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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Anestesiar, intubar e inocular animales
NOTA: Se recomiendan ratas Sprague-Dawley macho inmunocompetentes libres de patógenos específicos (SPF) que pesen entre 100 y 120 g. Proporcionar a todos los animales comida y agua ad libitum y alojarlos socialmente en astillas de madera u otro lecho absorbente con ciclos estándar de luz y oscuridad de 12 horas.
- Antes de realizar cualquier experimento, obtenga y esterilice una cánula de metal y un tubo de polietileno del tamaño apropiado para la especie animal. Obtenga jeringas desechables estériles de 1 mL y agujas desechables estériles de calibre 25.
cautela: Deseche siempre estas jeringas y agujas en un recipiente para objetos punzocortantes.
- Para ratas, compre o fabrique una cánula de metal que tenga aproximadamente 12 cm de largo, tenga un diámetro interno de 0,9 a 1,0 mm y un diámetro exterior de 1,0 a 1,2 mm y esté doblada en un ángulo aproximado de 45 ° en un extremo. Corte una longitud de 11 a 12 pulgadas de tubo de polietileno con un diámetro interior de 0.4 mm y un diámetro exterior de 0.8 mm. (Consulte la Figura 1A).
- Coloque la cánula de metal en un tubo de vidrio, con tapa de rosca y autoclave mediante métodos estándar para esterilizar. Remoje y guarde los trozos cortados del tubo de polietileno en un vaso de precipitados cubierto que contenga alcohol.
- Prepare la superficie de trabajo y el dispositivo de intubación.
- Coloque una alfombra desechable limpia sobre la superficie de trabajo, cerca del baño de agua. Transfiera la cánula de metal, en su tubo de almacenamiento de vidrio, a esta superficie. Retire la tapa del tubo de almacenamiento y deslice el extremo del "mango" de la cánula hasta el extremo abierto del tubo.
- Con pinzas estériles, retire un trozo de tubo de polietileno del vaso de precipitados e insértelo a través del interior de la cánula metálica estéril, asegurándose de que se mueva libremente. Coloque una aguja estéril desechable de calibre 25 (para ratas) en el extremo libre del tubo de polietileno deslizando la aguja varios mm dentro del tubo. (Consulte la Figura 1A para ratas).
- Coloque marcas de guía tanto en la cánula metálica como en el tubo de polietileno para indicar la profundidad de inserción en el animal siguiendo el procedimiento de intubación que se describe a continuación en un solo animal sacrificado. Abra la cavidad torácica para observación, luego coloque la cánula de metal correctamente y avance el tubo de polietileno de manera adecuada. Con un bolígrafo indeleble, marque la cánula de metal donde se encuentra con la boca del animal y el tubo de polietileno donde se encuentra con la parte superior de la cánula de metal para ayudar a la colocación adecuada en los animales restantes.
- Dentro de una campana extractora (o utilizando un sistema de eliminación adecuado), anestesiar hasta 6 animales a la vez en una cámara cerrada suministrada con isoflurano al ≤5% en oxígeno de 1,5 L/min hasta que se inhiba el reflejo nauseoso (aproximadamente 1 min)
nota: Antes de realizar cualquier experimento, determine la dosis segura y el tiempo de exposición al isoflurano en las condiciones específicas que se utilicen (por ejemplo, tamaño/tipo de cámara y tamaño/especie/cepa del animal) para evitar una exposición letal inadvertida.
- Llene una jeringa desechable estéril de 1 mL (para ratas) con solución salina estéril colocando la punta estéril en la solución salina y tirando de ella hacia atrás en el émbolo. Conecte la jeringa a la aguja colocada en el tubo de polietileno y enjuague todo el volumen de solución salina a través del tubo hasta que se vacíe la jeringa.
- Llene la jeringa con el inóculo a base de agar del recipiente en el baño de agua y enjuague el agar a través del tubo hasta que el tubo esté cebado (por ejemplo, completamente lleno con el agar).
- En el caso de las ratas, retire la aguja de calibre 25 (colocada en el tubo de polietileno) de la jeringa desechable. Deseche la jeringa usada en un recipiente para objetos punzocortantes. Llene una jeringa desechable nueva y estéril de 1 ml con el inóculo a base de agar del recipiente en el baño de agua colocando la punta estéril en el inóculo y tirando del émbolo hacia atrás. Vuelva a colocar la aguja (colocada en el tubo de polietileno) y enjuague el agar a través del tubo presionando el émbolo hasta que el tubo esté completamente lleno de agar.
- Retire un animal de la cámara de anestesia. Coloque al animal en posición supina sobre el tapete desechable con la cabeza hacia la derecha y la cola hacia la izquierda como se muestra en la Figura 1C.
- Utilizando el dispositivo de intubación (es decir, la cánula metálica provista de un tubo de polietileno), intuble al animal e inserte la cánula en el lóbulo grande del pulmón izquierdo (véase la figura 1D).
- Inserte el extremo libre de la cánula metálica en la boca del animal. Gire la cánula de modo que el extremo libre quede inclinado hacia arriba y acelere suavemente hacia la tráquea, evitando con cuidado las estructuras laríngeas con un ligero movimiento de torsión. Confirme la inserción en la tráquea en lugar del esófago deslizando suavemente la cánula ligeramente hacia adelante y hacia atrás varias veces mientras palpa los anillos traqueales con el dedo índice izquierdo como se muestra en la Figura 1C.
- Cuando la cánula llegue a la bifurcación donde la tráquea se divide en los bronquios izquierdo y derecho, haga un ligero movimiento de torsión hacia el lado izquierdo del animal para asegurarse de que la cánula se inserte en el bronquio izquierdo. Avance la cánula metálica hasta que el extremo esté a mitad de camino o tres cuartos del pulmón izquierdo, utilizando la marca guía colocada anteriormente para confirmar que se ha alcanzado la profundidad adecuada.
- Con la cánula metálica colocada, avance el tubo de polietileno varios mm. Utilice la marca guía previamente colocada en el tubo para asegurarse de que esté avanzado solo lo suficiente como para salir del extremo de la cánula metálica y no perforar el pulmón.
- Con ambas cánulas en su lugar, use la jeringa adjunta para instilar 100 μL (para ratas) de la suspensión de agar profundamente en el lóbulo grande del pulmón izquierdo (ver Figura 1D). Extraiga varios mm del tubo de polietileno y, a continuación, retire suavemente el dispositivo de intubación intacto. Vuelva a colocarlo en el tubo de almacenamiento de vidrio y mueva al animal a una jaula nueva para que se recupere.
