Canulación intraduodenal en un modelo de rata para estudios de inmunopatología

Resumen

Fuente: Trevaskis, N. L. et al., El modelo de rata canulada del conducto linfático mesentérico: aplicación a la evaluación del transporte de fármacos linfáticos intestinales.J. Vis. Exp.(2015)

Este video muestra la canulación intraduodenal en un modelo de rata. Después de anestesiar a la rata, se localiza el duodeno y se crea una pequeña punción. Se inserta y asegura cuidadosamente una cánula en forma de J con una punta biselada, y se cierra la incisión. El modelo de rata canulada permite la infusión intraintestinal para estudios de inmunopatología.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Preparativos el día antes del procedimiento quirúrgico

1. Ayuna a la rata la noche antes de la cirugía si es necesario. Asegúrate de que la rata tenga libre acceso al agua.
2. Prepare las soluciones que se administrarán a la rata.
   1. Prepare una solución de rehidratación, como solución salina estéril o solución de Ringers.
   2. Prepare las soluciones anestésicas según sea necesario. El anestésico utilizado en los experimentos aquí descritos consistió en el "Cóctel 1" preparado combinando 1,9 ml de ketamina 100 mg/ml, 0,5 ml de xilacina 100 mg/ml, 0,2 ml de acepromazina 10 mg/ml y 2,5 ml de solución salina y el "Cóctel 2" compuesto por 1 ml de ketamina 100 mg/ml y 0,1 ml de acepromazina 10 mg/ml. NOTA: Se puede preferir el isoflurano inhalado o el sevoflurano, ya que pueden proporcionar un plano quirúrgico de anestesia durante un período de tiempo más largo.
3. Prepare una solución anticoagulante que contenga 10 mg/ml de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) en agua estéril o 10 UI/ml de heparina en solución salina para enjuagar la cánula linfática. Además, prepare una solución anticoagulante que contenga 2,5 - 10 UI/ml de heparina en solución salina para enjuagar la cánula de la arteria carótida.
4. Prepare la cánula de polietileno para su inserción en el duodeno (0,96 mm de diámetro exterior, 0,58 mm de diámetro interior)
   1. Corte la cánula a la longitud requerida (generalmente de 25 a 30 cm para la cánula duodenal) y coloque un bisel en la punta de la cánula con una cuchilla quirúrgica estéril (consulte la Figura 1><). nota: Esto aumenta la facilidad de inserción de la cánula y reduce la incidencia de bloqueo de la cánula después de la inserción.
   2. Coloque un punto de anclaje en forma de J en la cánula intraduodenal enrollando una pequeña porción de la cánula sobre sí misma, calentándola con un encendedor o una placa caliente y luego cortándola a medida (véase la Figura 1).
5. Conecte la cánula linfática a una aguja de 25 G y a una jeringa que contenga una solución anticoagulante (preparada en el paso 1.3). Llene la cánula linfática con la solución anticoagulante y deje la solución en la cánula durante la noche (O/N) para reducir la incidencia de formación de coágulos en la cánula linfática durante la recolección de la linfa.
6. Prepare los tubos para la recolección de muestras de linfa y sangre. Pesa previamente los tubos de recolección de linfa, etiqueta los tubos para la recolección de muestras de linfa y sangre y agrega una solución anticoagulante. Añadir suficiente solución anticoagulante para alcanzar una concentración final de 1 mg/ml de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) en agua estéril o de 10 a 20 UI/ml de heparina en la linfa o sangre recolectada.

>2. Preparativos inmediatamente antes de comenzar el procedimiento quirúrgico

1. Revise las cánulas enjuagándolas con solución salina estéril o anticoagulante para asegurarse de que estén permeables.
2. Prepara a la rata para el procedimiento quirúrgico.
   1. Anestesiar a la rata durante todo el período quirúrgico y de recolección de muestras.
      1. Por ejemplo, iniciar la anestesia mediante una inyección subcutánea de 1,5 ml/kg de Cocktail I (del paso 1.2.2) en un pliegue cutáneo en la parte posterior del cuello de la rata utilizando una jeringa de 1 ml conectada a una aguja de 25 G. Mantener la anestesia mediante inyección intraperitoneal de 0,44 ml/kg de Cocktail 2 (a partir del paso 1.2.2) aproximadamente cada hora, según sea necesario, utilizando una jeringa de 1 ml conectada a una aguja de 25 G.
      2. Antes de comenzar la cirugía, asegúrese de que la profundidad de la anestesia sea suficiente observando la frecuencia respiratoria, el movimiento de los bigotes, el tono muscular y las respuestas a estímulos como el pellizco del pie. Administre anestesia adicional según sea necesario.
   2. Afeitar el pelaje de las regiones quirúrgicas, que incluyen el lado derecho del abdomen, para la canulación del duodeno.
   3. Limpie las regiones quirúrgicas asépticamente con una solución de povidona yodada o una solución de clorhexidina y un exfoliante con etanol al 70%. Repita esto 3 veces para cada región, terminando con una limpieza final con 70% de etanol.
3. Coloque al animal en decúbito dorsal sobre una sábana limpia sobre una almohadilla quirúrgica caliente (37 °C).

>3. Canulación del duodeno

1. Coloque al animal con el lado derecho mirando hacia el operador. Realice la cirugía con o sin la ayuda de un microscopio quirúrgico según sea necesario.
2. Abra la capa superior de la pared muscular abdominal con una incisión recta de 4 cm que se extienda desde la línea media (apófisis xifoides) hasta el flanco derecho aproximadamente 2 cm por debajo de la caja torácica (margen costal) utilizando una hoja de bisturí estéril (véase la figura 2B).
3. Abra las capas restantes de la pared muscular abdominal desde 4 a 5 mm laterales hasta la línea media hasta el flanco derecho con un pequeño par de tijeras quirúrgicas (véase la figura 2B).
4. Retraiga el intestino delgado debajo de la pared muscular abdominal izquierda y manténgalo en su lugar con 2 a 3 piezas de gasa estéril saturada con solución salina normal.
5. Conecte la cánula de duodeno a una jeringa (por ejemplo, 10 ml) llena de la solución de rehidratación.
6. Identifica el duodeno como la sección de color rosa brillante (con más vasos sanguíneos) del intestino delgado, que al tirar suavemente hacia abajo revela el estómago.
7. Haga un pequeño orificio de punción en el duodeno aproximadamente 2 cm por debajo de la unión del estómago y el duodeno (el píloro) con una aguja estéril de 23 G.
8. Inserte el extremo en forma de gancho en forma de J de la cánula duodenal a través del orificio de punción. Asegúrelo en su lugar con una gota de pegamento de cianoacrilato.
9. Comience la hidratación de la rata conectando la cánula a la jeringa de rehidratación cargada en una bomba de infusión. Según la literatura, las tasas de rehidratación oscilan entre 0,5 y 3 ml/h.
10. Después de completar la canulación de linfa y duodeno, cierre la incisión en la pared del músculo abdominal con suturas. A continuación, cierre la incisión cutánea aplicando unas gotas de adhesivo tisular (cianocrilato) a lo largo del lado de la incisión y pellizcando la piel de ambos lados de la incisión.

Resultados

Figura 1. Representación esquemática de la forma de la punta biselada de una arteria carótida o cánula linfática, y la punta biselada en forma de J de una cánula duodenal.

Figura 2. Fotografías de (A) el abdomen afeitado en preparación para canular el ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Solución salina estéril	Cuidado de la salud de Baxter	AHB 1307	Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo aquí son las bolsas de solución salina Baxter de 100 ml, caja de 50
70 % de etanol en agua	cualquier		Se puede utilizar cualquier marca
Solución de gluconato de clorhexidina (Microshield 4)	Livingstone Internacional	JJ60243L	Se puede utilizar cualquier marca. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
Solución Betadine	Livingstone Internacional	BU0510	Se puede utilizar cualquier marca. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
Ilium Ketamil (Ketamina 100 mg/ml)	PROVET VICTORIA	KETA I 1	http://www.provet.com.au/
Ilium Xylazil (Xilacina 100 mg/ml)	PROVET VICTORIA	TRO-3828	http://www.provet.com.au/
ACP 10 Inyección (Acepromazina 10 mg/ml)	PROVET VICTORIA	VTG-DACP010020	http://www.provet.com.au/
Heparina (35000U.I. en 35 mL)	Sigma Pharmaceuticals	337220	http://sigmaco.com.au/
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), sal disódica dihidratada	Sigma-Aldrich	E1644	Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo aquí es la sal disódica de EDTA de Sigma.
Cánula de polietileno (PE) de 0,96 mm x 0,58 mm de diámetro interno	Extensiones de microtubos	PE8050	Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo de ello es el tubo de PE de 0,8x0,5 mm, 30 m
Cánula de polietileno (PE) diámetro exterior 0,8 mm x diámetro interno 0,5 mm	Extensiones de microtubos	PE9658	Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo de ello es el tubo de PE de 0,96x0,58 mm, 30 m
gobernante	cualquier		Se puede utilizar cualquier marca
Marcadores	cualquier		Se puede utilizar cualquier marca
encendedor	cualquier		Se puede utilizar cualquier marca
Pegamento de cianoacrilato	cualquier		Se puede utilizar cualquier marca
Agujas de calibre 23	Livingstone Internacional	DN23GX0.75LV	Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo aquí es Livingstone Aguja Desechable, Estéril, 23GX0.75inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =DN23GX0.75LV
Agujas de calibre 25	Livingstone Internacional	DN25GX1.0LV	Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo de ello es la Aguja Desechable Livingstone, Estéril, 25GX1.0inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =DN25GX1.0LV
Jeringa de 1 ml	Livingstone Internacional	T3SS01TA	Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo aquí es la jeringa Terumo 1 ml Slip Tuberculin 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =T3SS01TA
Jeringa de 10 ml	Livingstone Internacional	T3SS10SA	Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo aquí es la jeringa Terumo 10 ml Slip 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =T3SS10SA
Hisopos de gasa	Livingstone Internacional	GSC075	Se puede usar cualquier marca y cortar al tamaño requerido. Un ejemplo aquí es el hisopo de gasa relleno de algodón de 7,5x7,5 cm, 8 capas. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =GSC075
Almohadilla térmica	Ratek	WT1	Se puede utilizar cualquier marca que mantenga la temperatura a 37 ° C. Un ejemplo de ello es la bandeja de calentamiento Ratek.
Lámpara quirúrgica	Aparato de Harvard	72-0215 con 72-0267	Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo aquí es el aparato de Harvard V-Lux 1000 Fuente de luz fría con guía de luz de cuello de cisne bifurcada, negro, fibra de 4,7 mm de diámetro (cada brazo). http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_50601_
Microscopio quirúrgico	Zeiss	495005-0014-000	Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo de ello es el microscopio estereoscópico Zeiss Stemi 2000-C con Stand S Double Spot y KL 300 LED. https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&p=us&f=e&i=10143
Sutura de seda	Livingstone Internacional	DTSK163019F4	Se puede utilizar cualquier marca. Ejemplo aquí es: * Enviar este artículo por correo electrónico a mi amigo 3/8 Círculo Corte de seda de corte inverso 3/0 Hilo 19 mm. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =DTSK163019F4
Hojas de bisturí	Herramientas de Bellas Ciencias, (FST)	10020-00	Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo de ello es la hoja de bisturí FST #20. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=191
Mango de bisturí	Herramientas de Bellas Ciencias, (FST)	10004-13	Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo de ello es el mango de bisturí FST #4. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=298&CategoryId=51
1 x Tijeras quirúrgicas pequeñas	Herramientas de Bellas Ciencias, (FST)	14060-09	Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo aquí es FST Tijeras finas, de 9 cm con filo de 21 mm, afiladas, rectas. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=40&CategoryId=17
2 x Pinzas con punta curva dentada	Herramientas de Bellas Ciencias, (FST)	11001-13	Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo de ello es la pinza de patrón estándar FST de 13 cm con punta curvada de 2,8x1,4 mm. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=405&CategoryId=32
2 x Hemostáticos	Herramientas de Bellas Ciencias, (FST)	13010-12	Se puede utilizar cualquier marca. No todos los operadores utilizan los hemostáticos. Un ejemplo de ello son los micromosquitos FST de 12 cm con punta recta dentada de 20 mm de largo x 1,3 mm de ancho. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=377&CategoryId=33
1 x Portaagujas de sutura	Herramientas de Bellas Ciencias, (FST)	12001-13	Se puede utilizar cualquier marca. Un ejemplo aquí es el portaagujas Hasley FST de 13 cm con punta de 16 mm de largo x 1,9 mm de ancho. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=254&CategoryId=70