Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
>1. Preparación del extracto de la glándula lagrimal
NOTA: Las ratas fueron anestesiadas con la inyección intraperitoneal de ketamina (75 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg). La anestesia adecuada se confirmó mediante pinzamiento de los dedos de los pies y de la cola. Se aplicó gel oftálmico en los ojos de la rata para evitar la sequedad después de cada procedimiento. Las ratas anestesiadas se colocaron bajo luces infrarrojas lejanas para mantener a los animales calientes hasta que se recuperaran por completo. Durante los procedimientos y el tiempo de recuperación, los animales fueron monitoreados de cerca por los investigadores. Todos los materiales y herramientas quirúrgicas fueron estériles antes de su uso. Al final del experimento, las ratas fueron sacrificadas mediante la inyección intraperitoneal de pentobarbital (80 mg/kg). La eutanasia completa se verificó por falta de pulso cardíaco y sin reflejo de parpadeo al tocar el globo ocular. Las ratas se alojaron en condiciones estándar: temperatura ambiente, 21-23 °C; humedad relativa, 30-70%; Ciclo de luz-oscuridad, alternando 12 h (7 AM a 7 PM).
- Coloque las ratas hembras Sprague-Dawley sacrificadas (rango de edad de 8 a 16 semanas) en posición horizontal, con una oreja contra la mesa y la otra hacia arriba. Haga una incisión de 10 mm superior-inferior debajo de la oreja expuesta con unas tijeras de resorte. Extirpe la glándula lagrimal diseccionándola del tejido conectivo circundante y del conducto de drenaje.
- Almacene las glándulas a -80 °C hasta que sea necesario. Descongela las glándulas en hielo. Picar lo más finamente posible sobre hielo con unas tijeras. Añadir 150 μL de PBS con 1x inhibidor de la proteasa por glándula lagrimal.
- Sonicar las muestras en hielo durante 5 min a 20 kHz con el sonicador ajustado a 10 s encendido y 10 s apagado al 30% de amplitud. Centrifugar las muestras sonicadas durante 20 minutos a 13.000 x g y 4 °C.
- Pipetear el sobrenadante y transferirlo a un nuevo tubo. Alicuente el sobrenadante en tubos de 1,5 mL y guárdelos a -80 °C. Mida la concentración de proteínas con un ensayo de ácido bicinconínico, según las instrucciones del fabricante.
>2. Preparación de la emulsión y la toxina de la tos ferina
- emulsión
- Añadir 40 mg de Mycobacterium tuberculosis H37Ra matado por calor en 10 mL de adyuvante completo de Freund que contenga 1 mg/mL de Mycobacterium tuberculosis H37Ra y mezclar bien.
nota: El adyuvante de Freund completo final contiene 5 mg/mL de Mycobacterium tuberculosis H37Ra.
- Pesar la ovoalbúmina, disolverla en PBS y preparar una mezcla de antígenos que contenga 2 mg/mL de ovoalbúmina y 10 mg/mL de extracto de glándula lagrimal. Con el objetivo de obtener un volumen de inyección de 200 μL para cada animal, prepare una mezcla maestra basada en el número de animales.
- Transfiera el adyuvante de Freund incompleto o el adyuvante de Freund completo a un tubo de 50 mL, asegurándose de que el volumen de adyuvante a la mezcla de antígenos esté en una proporción de 1:1. Agregue la mezcla de antígenos gota a gota al adyuvante mientras se agita el vórtice a la velocidad más alta para que no se derrame. Continúe el vórtice durante 5 minutos después de que se haya agregado todo el antígeno.
- Transfiera la emulsión a una jeringa de 5 mL y conéctela con otra jeringa de 5 mL a través de un conector de jeringa. Empuje la emulsión de una jeringa a la otra para mezclarla.
nota: La emulsión está lista si una sola gota permanece como una esfera cuando se coloca en el agua. Solo se debe utilizar emulsión recién preparada o emulsión almacenada durante la noche a 4 °C.
- Toxina de la tos ferina
- Reconstituya 50 μg de toxina pertussis en 500 μL de agua para obtener una concentración final de 100 ng/μL. Votex el recipiente durante 30 segundos para asegurarse de que la toxina se disuelve completamente.
nota: No esterilice por filtración, ya que esto resultará en una pérdida de material. No congelar. Esta solución permanece activa durante al menos 6 meses a 4 °C.
- Diluya 100 ng/μL de toxina pertussis a 3 ng/μL usando PBS. Transfiera 100 μL de la toxina de la tos ferina diluida a una jeringa inyectable Luer-lock de 1 mL con una aguja de 27 G.
3. Inmunización de las ratas de Lewis
- El día 0, mezcle la emulsión unas cuantas veces. Distribuya 200 μL de la emulsión, que contiene 1 mg de extracto de glándula lagrimal y 200 μg de ovoalbúmina en el adyuvante completo de Freund, en jeringas Luer-lock de 1 mL con agujas de 27G. Inyecte la emulsión por vía subcutánea en la base de las colas de rata sin anestesia.
nota: No es necesario precalentar la cola antes de la inyección. Cada rata se inmuniza con 1 mg de extracto de glándula lagrimal y 200 μg de ovoalbúmina en el adyuvante completo de Freund con 500 μg de Mycobacterium tuberculosis H37Ra.
- El día 14, inyectar 200 μL de la emulsión, que contiene 1 mg de extracto de glándula lagrimal y 200 μg de ovoalbúmina en el adyuvante de Freund incompleto, de la misma manera que el día 0. Inyectar 300 ng de toxina pertussis en 100 μL de PBS por vía intraperitoneal por rata el mismo día.
>4. Inyección de la mezcla de antígenos en la subconjuntiva forniciana y la glándula lagrimal para reclutar células inmunitarias específicas de antígenos y causar inflamación local
- Calcule la cantidad de ovoalbúmina y extracto de glándula lagrimal en función del número de ratas en el experimento. Pesar la cantidad necesaria de ovoalbúmina y combinarla con el extracto de glándula lagrimal descongelado preparado en el paso 1, haciendo una solución de antígeno que contiene 1 mg/mL de ovoalbúmina y 1 mg/mL de extracto de glándula lagrimal.
- Anestesiar a las ratas con ketamina (75 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg) mediante inyección intraperitoneal. Pellizque los dedos de las ratas para asegurarse de que se haya logrado la anestesia adecuada (es decir, no se observe ningún movimiento de respuesta después del pellizco). Inyecte 5 μL de antígeno en la subconjuntiva forniciana del ojo. Inyecte 20 μL de antígeno en la glándula lagrimal.
