>Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
1. Siembra de células peritoneales en portaobjetos de canal
- Después de pipetear la suspensión de células de macrófagos de ratón peritoneal hacia arriba y hacia abajo para reducir la aglomeración, pipetee la suspensión de 100 μL en el canal prellenado (volumen, 100 μL) de un portaobjetos de canal recubierto de fibronectina (un canal de 100 μL tiene las dimensiones (largo x ancho x alto): 50 mm x 5 mm 0,4 mm).
- Llene previamente la cámara agregando 1 mL de medio RPMI 1640 (Hepes) suplementado con suero a uno de los dos depósitos del portaobjetos del canal, inclinando el portaobjetos y luego aspirando el medio desde el depósito aguas abajo (Figura 1).
- Elimine las burbujas de aire no deseadas, o tiras largas de aire, en el canal agregando 1-2 ml de medio a uno de los dos depósitos, aplicando firmemente una tapa del depósito y luego bombeando el aire a través de la presión rítmica del pulgar sobre la tapa y, cuando sea necesario, inclinando la corredera. Después de expulsar el aire, incline la corredera con el depósito destapado (y que contiene medio) hacia abajo antes de quitar la tapa para evitar que el aire sea aspirado de regreso al canal.
- Incubar el portaobjetos de canal, sembrado con células, en una cámara húmeda durante 2 h a 37 °C en ausencia de CO2 (no se requiere CO2 ya que el sistema tampón HCO3-/CO2 se sustituye por Hepes). Las guías de canal se pueden colocar cómodamente en un estante con capacidad para ocho guías. Normalmente, se preparan entre 6 y 8 diapositivas con un ratón, aunque es posible hasta 10 o más.
- Retire la gradilla y cambie el medio RPMI 1640 (Hepes) en cada portaobjetos por el medio RPMI 1640 que contiene bicarbonato, suplementado con un 10% de suero fetal bovino, así como penicilina/estreptomicina.
- Incline la corredera y aspire el medio primero desde el depósito inferior y luego desde el depósito superior. A continuación, agregue 1 mL del nuevo medio a uno de los depósitos, incline el portaobjetos y aspire el medio desde el depósito aguas abajo, después de que haya fluido a través del canal.
- Después de este paso de lavado (intercambio de medio), llene el portaobjetos del canal agregando 1 mL de medio a uno de los depósitos.
nota: Los pasos de lavado con portaobjetos de canal son muy sencillos y eficaces en términos de intercambio de soluciones y eliminación de células no adherentes. Tenga en cuenta que el medio RPMI 1640 (bicarbonato) normalmente se preincuba con 5% de CO2 durante la noche para garantizar el equilibrio térmico y de pH.
- Incubar las células durante la noche a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO2. Realiza experimentos al día siguiente.
>2. Aislamiento de glóbulos rojos humanos
- El día 2 (el segundo día de experimentos; después de la incubación nocturna de los macrófagos peritoneales aislados), recoja 1-2 ml de sangre venosa periférica de un donante sano, en un tubo heparinizado. Transfiera 1 mL a un tubo de microcentrífuga de 2,0 mL (polipropileno) de fondo redondo, centrifugue a 300 x g durante 5 min a 18 °C (ajuste empírico) y retire el sobrenadante (plasma y capa leucocitaria).
- Aspire suavemente 100 μL de los glóbulos rojos sedimentados y mezcle este volumen 1:1 con el medio RPMI 1640 (Hepes) modificado (descrito a continuación) en un tubo de microcentrífuga de 2,0 mL de fondo redondo. Etiquete el tubo "1:1".
nota: El medio RPMI 1640 (Hepes) utilizado el día 2 (para los ensayos) después de aislar las células contiene, además de un 10% de suero fetal bovino inactivado por calor, penicilina (100 unidades/mL), estreptomicina (100 μg/mL) y 1 mM de N-(2-mercaptopropionil)glicina (para reducir la fototoxicidad). En lo sucesivo, este medio se denomina medio RPMI 1640 (Hepes) "modificado".
- Pipetear 4 μL de la suspensión de glóbulos rojos diluidos 1:1 en 2 mL de medio RPMI 1640 modificado (Hepes), prepipeteado en un tubo de microcentrífuga de 2,0 mL (repita este paso, es decir, prepare 2 tubos). Etiquete cada tubo como "4:2000". Coloque los tubos "1:1" y "4:2000" sobre hielo.
>3. Marcaje de la membrana plasmática de macrófagos
- Retire los portaobjetos de canal sembrados de la incubadora de CO2 y cambie el medio RPMI 1640 (bicarbonato) de cada portaobjetos por un medio RPMI 1640 (Hepes) modificado. A continuación, coloque las células en una cámara húmeda a 37 °C en ausencia de CO2.
nota: Después de la incubación y el lavado durante la noche, la mayoría de los linfocitos se eliminan del canal. La mayoría de las células adherentes restantes son macrófagos, que pueden identificarse morfológicamente o mediante tinción de inmunofluorescencia utilizando el anticuerpo anti-F4/80. Alrededor del 95% de los macrófagos peritoneales residentes en ratones son F4/80 positivos.
- Anticuerpo anti-ratón F4/80 diluido marcado con verde fluorescente (almacenado a 4 °C) 1:40 en medio RPMI 1640 (Hepes) modificado. Tome un portaobjetos, inclínelo y pipetee (gota a gota) 100 μL de la mezcla de anticuerpos en la abertura del canal de 100 μL del portaobjetos (véase la figura 1). Aspire el medio que fluye hacia el depósito aguas abajo. Incubar las células durante 20 min a 37 °C (ambiente humidificado, sin CO2). Durante el período de incubación, etiquete los glóbulos rojos humanos (ver sección 5).
nota: Como se ha mencionado anteriormente, el CO2 no es necesario ya que el sistema tampón HCO3-/CO2 se sustituye por Hepes.
- Después de 20 minutos de tiempo de incubación (durante el cual los glóbulos rojos humanos se tiñen y se opsonizan), lave el portaobjetos añadiendo 1 ml de medio RPMI 1640 modificado (Hepes) a uno de los depósitos y aspire el medio después de que haya fluido a través del canal, facilitado por la inclinación del portaobjetos. Agregue 1 mL de medio para almacenamiento a corto plazo o proceda a un experimento (es decir, pipeteo en partículas (glóbulos rojos opsonizados) e imágenes de la fagocitosis mediante microscopía confocal de disco giratorio de lapso de tiempo).
>4. Marcaje de la membrana plasmática de los glóbulos rojos humanos
- Comience el marcaje de los glóbulos rojos humanos inmediatamente después de incubar un portaobjetos de macrófagos con anticuerpo anti-F4/80 marcado con fluorescencia verde (después de la sección 3.2). Después de mezclar suavemente, tome 400 μL de uno de los tubos "4:2000" (ver Sección 2.3) y dispense en un tubo de microcentrífuga (fondo redondo) de 2,0 mL. Deje tiempo para que la suspensión se caliente a alrededor de 37 °C (consulte el párrafo a continuación). Añadir 0,4 μL de tinción de membrana plasmática fluorescente naranja/roja (alícuotas almacenadas a -20 °C), mezclar e incubar a 37 °C durante 5 min.
nota: Un bloque de aluminio calentado, colocado dentro de la campana de flujo laminar, es útil para minimizar la pérdida de calor mientras se preparan los portaobjetos. Los tubos se pueden colocar en los pozos del bloque calefactor y una placa de aluminio calentada separada o integrada puede servir como espacio de trabajo.
- Después del período de incubación de 5 minutos, prepare el primer paso de lavado agregando 1600 μL de medio RPMI 1640 modificado (Hepes) (para llenar el tubo de microcentrífuga de 2,0 mL).
- Centrifugar el tubo a 300 x g durante 5 min a 18 °C (ajuste empírico). Un pellet rojo compacto debe ser visible en la pared (es decir, descentrado) en la parte inferior del tubo. Gire el tubo de modo que el pellet quede hacia arriba y retire con cuidado todo el sobrenadante sucesivamente (en dos pasos) con una punta de pipeta de 1-1,5 ml.
- Después de aspirar el sobrenadante, agregue 2,000 μL de medio RPMI 1640 (Hepes) modificado, mezcle (para resuspender las células) y repita los pasos de centrifugación y aspiración del sobrenadante anteriores.
- Vuelva a suspender el pellet (de membrana plasmática teñida y 2 glóbulos rojos lavados) con 400 μL de medio RPMI 1640 (Hepes) modificado. Etiquete el tubo PMS (abreviatura de tinción de membrana plasmática).
nota: Alternativamente, el éster de succinimidilo de un derivado de rodamina sensible al pH, que se vuelve más fuertemente fluorescente a pH ácido, podría usarse para marcar los glóbulos rojos humanos. En este caso, la intensidad de la fluorescencia sirve adicionalmente como medida de la maduración del fagosoma después de que las partículas se han internalizado.
>5. Opsonización (etiquetado) de glóbulos rojos humanos con inmunoglobulina G (IgG) de ratón
- Añadir 1 μL de anticuerpo monoclonal (clon HIR2) anti-CD25a (1 mg/mL) de ratón (IgG2b) (almacenado a -20 °C) al tubo marcado con PMS (ver Secciones 4.2-4.5), que contiene glóbulos rojos humanos teñidos con membrana plasmática suspendidos en medio de 400 μL. CD235a (también conocida como glicoforina A) es una sialoglicoproteína de membrana específica del linaje eritroide.
- Incubar a 37 °C durante 8 min. Tenga en cuenta que la opsonización de los glóbulos rojos humanos con IgG provoca aglutinación (aglomeración de células). Aunque la aglutinación puede servir como un indicador visual de opsonización, no es deseable para la obtención de imágenes de efectos fagocíticos individuales. Para evitar la aglutinación, mezcle repetidamente la suspensión celular (cada 1 min) utilizando, por ejemplo, una pipeta de volumen variable de 20-200 μL ajustada a 200 μL.
- Hacia el final del período de incubación de 8 minutos, si lo desea, lave el portaobjetos de macrófagos, incubado con anticuerpo anti-F4/80 marcado con fluorescencia verde, con medio RPMI 1640 (Hepes) modificado de 1 mL. Asegúrese de que ambos depósitos del canal se abran y estén libres del medio después de los pasos de lavado.
>6. Obtención de imágenes de la fagocitosis de glóbulos rojos humanos teñidos con membrana plasmática y recubiertos de IgG
- Después de la incubación de 8 minutos con el anticuerpo anti-CD235a (Sección 5.2), pipetee 100 μL de suspensión que contiene glóbulos rojos humanos teñidos con membrana plasmática y opsonizados con IgG en el canal de un portaobjetos que contiene macrófagos marcados con anticuerpo fluorescente verde anti-F4/80 (Paso 3). Por lo tanto, los glóbulos rojos humanos fluorescentes rojos opsonizados con IgG se agregan a los fagocitos fluorescentes verdes (macrófagos).
- Tan pronto como se hayan añadido los glóbulos rojos humanos, monte el portaobjetos de canal en un microscopio confocal de disco giratorio (con la incubadora de platina ajustada a 37 °C) para obtener imágenes, por ejemplo, a través de una lente de objetivo de inmersión en aceite de 60X/1,49. Comience a tomar imágenes lo antes posible, ya que las partículas comienzan a depositarse dentro de 1 min.
nota: Utilizando perlas fluorescentes con un diámetro de 100 nm, medimos, mediante el análisis de las funciones de dispersión puntual, resoluciones XY de x = 0,22 μm, y = 0,23 μm (láser de 488 nm) y x = 0,27 μm, y = 0,27 μm (láser de 561 nm). Sin embargo, para reducir el fotoblanqueo y la fototoxicidad durante las imágenes 3D de lapso de tiempo de células vivas, comprometemos la resolución espacial mediante el agrupamiento 2 x 2. La discretización aumenta la sensibilidad (mejora la relación señal-ruido) y la velocidad de fotogramas permitida, pero a expensas de la resolución espacial.
- Utilice un sistema de enfoque perfecto (o similar) para evitar la desviación del enfoque durante las grabaciones. Después de activar el sistema de enfoque perfecto, utilice el control de desplazamiento para enfocar las protuberancias lamelipodiales de los macrófagos inmediatamente por encima del cubreobjetos (ver nota a continuación) de la diapositiva del canal. Este nivel de enfoque corresponde a Z = 0 μm. Obtenga pilas Z de -1 μm a +16 μm en pasos de 0,8 μm, lo que equivale a 22 cortes Z. Las pilas Z se pueden obtener, por ejemplo, a una velocidad de 1 pila (para cada canal) cada 15 s durante un total de 16 min.
nota: Los períodos de grabación más largos sufren pérdidas de calidad de imagen, principalmente debido al fotoblanqueo. Se adquieren pilas Z para cada uno de los dos canales: se obtienen imágenes de los macrófagos con un láser de 488 nm (canal verde) y se obtienen imágenes de los glóbulos rojos humanos con un láser de 561 nm (canal rojo). Con este enfoque, se pueden obtener varias vistas de macrófagos ingiriendo glóbulos rojos humanos con IgG opsonizados en diferentes puntos de tiempo (por ejemplo, ver Figura 2)
nota: Los ajustes típicos del sistema (con agrupación de 2 x 2) son: canal verde (20,5% de potencia láser (50 mW; 488 nm), sensibilidad de 101 (rango, 0-255) y tiempo de exposición de 200 ms); canal rojo (10,5% de potencia láser (50 mW; 561 nm), sensibilidad 101 (rango, 0-255) y tiempo de exposición de 98 ms)
nota: La parte inferior del portaobjetos del canal es un polímero con el mismo grosor que un cubreobjetos de vidrio # 1.5 y las mismas propiedades ópticas del vidrio, pero, en particular, el material tiene la ventaja de la permeabilidad al gas.
