Tinción de acetoximetilo de calceína para evaluar la citotoxicidad mediada por células asesinas naturales hacia las células cancerosas

Resumen

Fuente: Chava, S. et al., Medición de la citotoxicidad y migración mediada por células asesinas naturales en el contexto de las células tumorales hepáticas. J. Vis. Exp. (2020)

Este video muestra un ensayo para medir la citotoxicidad de las células asesinas naturales contra las células cancerosas utilizando la tinción de Calceína AM. La reducción del número de células cancerosas fluorescentes después del cocultivo con células asesinas naturales indica citotoxicidad mediada por células asesinas naturales hacia las células cancerosas.

Protocolo

>1. Método microscópico basado en la tinción de calceína AM para medir la citotoxicidad mediada por células NK

1. Cultivo de células SK-HEP-1 con una confluencia del 70-80%. Genere una suspensión unicelular lavando primero las células con 5 mL de PBS 1x seguido de incubación con 1 mL de tripsina-EDTA al 0,25%.
2. Centrifugar las células SK-HEP-1 en un tubo de centrífuga estéril de 1 mL a 160 x g durante 3 min. Vuelva a suspender el pellet en 3 mL de DMEM sin suero.
3. Añadir 1,5 μL de solución de calceína AM (10 mM) a las células SK-HEP-1 e incubar durante 30 min a temperatura ambiente. Centrifugar células SK-HEP-1 marcadas con calceína AM a 160 x g durante 3 min en un tubo de centrífuga estéril de 15 mL.
4. Lave las células dos veces con 5 ml de 1x PBS para eliminar el exceso de calceína del tinte AM.
5. En paralelo, centrifugar las células NK92MI a 160 x g durante 3 min en un tubo de centrífuga estéril de 15 mL. Lave el pellet celular una vez con 5 mL de 1x PBS y vuelva a suspender en 5 mL de medio celular NK92MI.
6. Cuente las células SK-HEP-1 marcadas con calceína AM y las células NK92MI utilizando un hemocitómetro o un contador de células automatizado.
7. Resuspenda las células SK-HEP-1 en el medio de cultivo a 1 x 10⁵ células/mL y las células NK92MI a 1 x 10⁶ células/mL en el medio celular NK.
8. Placa de calceína con células SK-HEP-1 marcadas con AM (células diana) (1 x 10⁴/100 μL/pocillo) con células NK92MI (células efectoras) (1 x 10⁵/100 μL/pocillo) (relación objetivo: efector 1:10) por pocillo en pocillos triplicados en una placa de 96 pocillos.
9. Incubar las placas de 96 pocillos a 37 °C en una atmósfera de 95% de aire y 5% de CO₂ durante 4 h. Después de la incubación, capture imágenes de fluorescencia de las células marcadas con calceína AM utilizando un microscopio de fluorescencia con un aumento de 10x. Capture al menos 10 campos diferentes de cada réplica para cada condición de tratamiento.
10. Seleccione aleatoriamente 10 imágenes para cada réplica y cuente las células diana marcadas con calceína AM positivas incubadas con o sin células NK92MI. Calcule el % de citotoxicidad utilizando la siguiente fórmula.
    
    nota: Como controles, utilice células diana sin células NK92MI y células diana completamente lisadas como control de lisis completo. Para una lisis completa, incubar las células en Triton X-100 al 0,5% durante 1 h (20 μL de Triton X-100 al 5% en 200 μL de medio de cultivo).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tinte Calceína AM	Sigma-Aldrich	Año 17783
DMEM	Gibco	11965-092
Suero Fetal Bovino	Gibco	26140079
Suero de caballo	Gibco	16050114
Células NK92MI	ATCC	CRL-2408
Tampón de fosfato salino (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417
Células SKHEP-1	ATCC	HTB-52
Solución de tripsina EDTA	Gibco	25200056