Medición de la migración de células asesinas naturales en respuesta a estímulos quimiotácticos

Resumen

Fuente: Chava, S., et al. Medición de la citotoxicidad y migración mediada por células asesinas naturales en el contexto de las células tumorales hepáticas. J. Vis. Exp. (2020).

Este video muestra un método para estudiar la migración de células asesinas naturales (NK) a través de un sistema de inserción de membrana porosa en respuesta a quimioatrayentes. Este método permite el análisis cuantitativo de la migración de células NK mediante citometría de flujo.

Protocolo

1. Ensayo de migración de células NK

1. Cultive células NK92MI y células centrífugas a 160 x g durante 3 min en un tubo de centrífuga estéril de 15 mL.
2. Lave el pellet celular dos veces con 5 mL de 1x PBS y vuelva a suspender las celdas en 3 mL de medio celular NK92MI sin suero. Cuente las células NK92MI con un hemocitómetro o un contador de células automatizado.
3. Placa de células NK92MI (2,5 x 10⁵ células/100 μL/pocillo) en el compartimento superior de la cámara permeable transwell (inserto de 6,5 mm de diámetro y tamaño de poro de 5 μm).
4. En la cámara inferior, agregue 0.6 mL de medio libre de suero que contenga material para probar las propiedades quimioatrayentes de las células NK (por ejemplo, medio acondicionado, quimiocinas, citocinas).
   nota: Al preparar el medio acondicionado, utilice un medio sérico reducido sin suero añadido para eliminar la interferencia de las proteínas séricas en el ensayo de migración.
5. Incubar las cámaras permeables de 24 pocillos a 37 °C durante 4 h. Después de 4 h, recoja las células NK92MI no adherentes y migradas de la cámara inferior y transfiéralas a tubos de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para su posterior análisis><. nota: El tiempo de cultivo puede variar en función del tipo de células diana, así como de la cantidad y cinética de las quimiocinas producidas por las células diana. Por lo tanto, este tiempo debe determinarse empíricamente para cada tipo de célula, quimiocina y experimento.
6. Añada un número predeterminado de perlas de recuento para la citometría de flujo en un volumen de 50 μL a cada tubo que contenga células NK migradas. Evalúe el volumen de 300 μL/pocillo de suspensión de celdas utilizando cualquier citómetro de flujo capaz de realizar un recuento automatizado de células basado en FACS.
   nota: Mezcle o mezcle en vórtice las perlas de recuento para la citometría de flujo minuciosamente cada vez antes de usarlas para asegurarse de que se utilice un número constante de perlas para minimizar la variabilidad experimental. Se recomienda el pipeteo inverso con cuentas de conteo para mantener la precisión. Utilice solo células NK y perlas de recuento para la citometría de flujo como controles de análisis FACS. Los autores recomiendan leer al menos 10.000 cuentas + células NK combinadas, una cantidad que ha funcionado bien. Sin embargo, este número puede variar dependiendo de las condiciones experimentales. Por lo tanto, el número combinado de perlas + células NK debe determinarse empíricamente para cada tipo de experimento. Además, es importante realizar experimentos utilizando triplicados biológicos para lograr resultados estadísticamente significativos y tener en cuenta la variabilidad entre los diferentes recuentos de células.
7. Calcule el número absoluto de celdas NK92MI migradas usando esta fórmula:
   
   donde A = número de celdas, B = número de cordones, C = recuento de cordones asignado del lote (número de cordones de recuento para citometría de flujo/50 μL; en este ejemplo 49.500) y D = volumen de la muestra (μL).
   nota: Si se utilizan 300 μL de volumen de muestra (células migradas) para el análisis FACS con 50 μL de perlas de recuento para la citometría de flujo, el número absoluto de células migradas = 1.700 células/3.300 eventos de perlas x 49.500 perlas/300 μL = 84,975 células/μL. El cálculo debe corregirse si la muestra se diluye o si se utiliza un volumen diferente de perlas de recuento FACS.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cuentas de conteo absolutas	Thermo Fisher Scientific	C36950
Células NK92MI	ATCC	CRL-2408
Células SKHEP-1	ATCC	HTB-52
Cámaras permeables Transwell	Coprotagonista	3241
Opti-MEM	Gibco	31985070
Tampón de fosfato salino (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417
Alfa-MEM	Sigma-Aldrich	M4256