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1. Preparar el complemento y las bacterias objetivo
- Prepare el complemento de conejo bebé (BRC)
NOTA: Los criterios detallados para la selección de lotes complementarios se pueden encontrar aquí: https://www.vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-MOPA.pdf
- Obtenga BRC congelado y descongele con agua fría corriente. Mezcle físicamente el BRC cada ~ 10-20 min hasta que esté completamente descongelado. No someta el BRC a ciclos repetidos de congelación y descongelación.
- Mientras se descongela el BRC, etiquete los tubos de centrífuga de 1,5 mL, 5 mL o 15 mL. Coloque los tubos etiquetados sobre hielo para que se enfríen previamente. Alícuota el volumen adecuado BRC a los tubos de centrífuga preenfriados (después del llenado, devuelva inmediatamente cada tubo al hielo). Almacene las alícuotas a ≤ -70 °C en el congelador.
nota: Se necesita aproximadamente 1 mL de complemento para cada placa de ensayo. Las alícuotas del complemento son de un solo uso y deben ser alícuotas en volúmenes apropiados para los diseños de los ensayos.
- Para preparar BRC inactivado por calor, descongele una alícuota de BRC activo. Prepare un baño de agua a 56 °C. Después de que BRC se haya descongelado por completo, transfiéralo al baño de agua e incube durante 30 minutos.
- Después de la incubación, retire el BRC inactivado por calor del baño de agua y deje que se enfríe a temperatura ambiente (RT) durante 10-15 min. Mezcle vigorosamente y alícuota de ~ 150 μL a 1,5 mL de tubos de microcentrífuga. Almacene las alícuotas a ≤ -10 °C.
- Prepare el caldo de bacterias objetivo
NOTA: El procedimiento que se indica a continuación se utiliza para preparar 48 alícuotas de stock de bacterias objetivo; Si se necesitan más alícuotas, el protocolo se puede ampliar.
- Retire el frasco de material maestro de bacterias del congelador y raspe la superficie bacteriana congelada para eliminar una pequeña cantidad de hielo del vial y colóquelo en una placa de agar sangre. Devuelva inmediatamente el vial de stock maestro al congelador.
- Vierta esta pequeña alícuota de caldo bacteriano en la placa de agar sangre y cúbrala con la tapa de la placa. Incubar la placa boca abajo durante la noche en una incubadora a 37 °C/5% deCO2.
- Transfiera ~ 10 colonias lisas aisladas a un tubo de 50 mL que contenga 30 mL de caldo LB. Incubar durante 3-5 h a 37 °C con una suave agitación hasta que el caldo de cultivo tenga un OD600 de ~0,6-0,7.
- Coseche los 12,5 mL superiores del cultivo y transfiéralos a un tubo nuevo de 50 mL. Centrifugar el cultivo a 15.000 x g durante 2 min utilizando una microcentrífuga de mesa. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 25 mL de glicerol-LB estéril al 15%.
- Mezcle bien y dispense alícuotas de 0,5 mL en tubos de microcentrífuga estériles de 1,5 mL (~48 tubos). Almacene las alícuotas a ≤ -70 °C en el congelador.
- Confirme la identidad bacteriana mediante la prueba de aglutinación antes de usar.
- Determinación del factor de dilución óptimo para el stock de bacterias objetivo
NOTA: Cada lote de stock de bacterias objetivo debe valorarse en condiciones de ensayo para determinar la dilución necesaria para producir ~ 120 UFC / punto en placas LB.
- Obtenga una placa de microtitulación (placa de dilución) y agregue 135 μL de tampón de ensayo al pocillo 1A. Agregue 120 μL de mantequilla de ensayo a los pocillos 1B-1H.
- Retire un vial de bacterias objetivo congeladas del congelador y descongele a temperatura ambiente. Agregue 15ul de caldo bacteriano descongelado al pocillo 1A para hacer una dilución de 10 veces el caldo bacteriano.
- Transfiera 30 μL de solución bacteriana del pocillo 1A al pocillo 1B para realizar una dilución en serie de 5 veces. Continúe con las diluciones en serie 5 veces hasta el pocillo 1H para un total de 8 diluciones (1:10; 1:50; 1:250; 1:1 250; 1:6 250; 1:31 250; 1:156 250; 1:781 250).
- Obtenga otra placa de microtitulación (placa de ensayo) y agregue 20 μL de tampón de ensayo a todos los pocillos de las columnas 1 y 2 de la placa de ensayo.
- Transfiera 10 μL de bacterias diluidas de cada pocillo de la columna 1 de la placa de dilución a los pocillos correspondientes de las columnas 1 y 2 de la placa de ensayo. Se transfieren 10 μL de bacterias del pocillo 1A de la placa de dilución a los pocillos 1A y 2A de la placa de ensayo, etc.
- Continúe con el ensayo como se describe en el Ensayo bactericida sérico (SBA) a continuación para el control A y el control B, pasos 3.6-3.12.
- Una vez que las placas se hayan incubado en hielo, utilice una pipeta multicanal con 8 puntas de pipeta para detectar 10 μL de los pocillos de la columna 1 en una placa LBA. Además, localice los pozos de la columna 2 en la placa LBA.
- Continúe con el ensayo como se describe a continuación en los pasos 3.14-4.6.
- Determine la dilución de bacterias que produce ~ 120 UFC / punto en el Control B, esta dilución se utilizará en el ensayo.
>2. Ensayo bactericida sérico (SBA)
NOTA: El procedimiento descrito a continuación es para una placa de ensayo, pero el número de placas de ensayo se puede aumentar.
- Muestras de prueba de inactivación por calor incubando muestras en un baño de agua a 56 °C durante 30 min.
nota: Las muestras de ensayo deben ser inactivadas por calor antes del ensayo para suprimir cualquier actividad endógena del complemento. Esto se puede hacer antes del ensayo y las muestras inactivadas se pueden volver a congelar o almacenar a 4 °C hasta que se analicen.
- Obtenga una placa de ensayo y agregue 20 μL de tampón de ensayo a las columnas 1 a 12 de las filas A a G. Agregue 20 μL de tampón de ensayo a las columnas 1 y 2 de la fila H, consulte la Tabla 1.
- Cargue 30 μl de cada muestra de ensayo, por duplicado, en la fila H de la placa de ensayo. Por ejemplo, dispense 30 μL de la muestra 1 en los pocillos 3H y 4H, y dispense 30 μL de la muestra 2 en los pocillos 5H y 6H, etc.
- Realice diluciones en serie de 3 veces de muestras de prueba utilizando una pipeta multicanal.
- Extraiga 10 μ de la muestra de los pocillos 3H-12H y transfiérala a los pocillos correspondientes en la fila G y mezcle el pocillo de la muestra pipeteando hacia arriba y hacia abajo 8-10 veces.
- A continuación, retire 10 μ de los pocillos 3G-12G y transfiéralos a los pocillos correspondientes de la fila F y mezcle bien.
- Continúe con estas diluciones en serie a través de la fila A. Después de mezclar los pocillos de la fila A, retire y deseche 10 μl de los pocillos 3A a 12A para que todos los pocillos contengan 20 μl.
nota: Debido a que se utilizan 20 μL de suero en un volumen total de ensayo de 80 μL, hay una dilución adicional de 4 veces en el ensayo. Esta dilución debe tenerse en cuenta durante el cálculo de un título de SBA multiplicando la dilución de suero por 4. Por ejemplo, si se utiliza una dilución inicial de 1:2, la dilución real que se está probando es 1:8.
- Retire un vial de caldo de bacterias objetivo congelado y descongele a temperatura ambiente. Diluya las bacterias en 20 mL de tampón de ensayo de acuerdo con el factor de dilución óptimo predeterminado (este factor de dilución se determinó en la sección 1.3). Añada 10 μl de bacterias diluidas a cada pocillo de la placa de ensayo con una pipeta multicanal.
- Retire un vial de BRC congelado y un vial de BRC congelado inactivado por calor, descongele a temperatura ambiente con agua fría corriente o colóquelo en la rejilla de un gabinete de seguridad biológica con aire de soplado para descongelar rápidamente.
- Prepare una solución al 20% de BRC inactivado por calor. Mezcle 100 μL de BRC inactivado por calor con 400 μL de tampón de ensayo. Agregue 50 μL de esta solución BRC inactivada por calor al 20% a todos los pocillos de la columna 1 (pocillos de control A).
nota: El BRC inactivado por calor se utiliza como control para monitorizar la muerte no específica (NSK) en el ensayo.
- Prepare una solución al 20% de BRC nativo. Mezcle 1 mL de BRC nativo con 4 mL de tampón de ensayo. Agregue 50 μL de esta mezcla a todos los pocillos de las columnas 2 a 12 (Pocillos de control B y pocillos de muestra de prueba).
nota: La concentración final de BRC en la mezcla de reacción es del 12,5%.
- Mezcle brevemente la placa de ensayo agitándola suavemente durante 10-15 s en un agitador de placas o mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo 8 veces con una pipeta multicanal.
- Coloque la placa de ensayo en una incubadora microbiológica a 37 °C durante 2 h (sin agitar).
- Seque 2 placas de LBA quitando las tapas y colocando las placas boca arriba en la cabina de seguridad biológica durante 40-60 min.
- Cuando se complete la incubación de 2 horas, mueva la placa de ensayo a hielo húmedo e incube durante 10-20 minutos para detener la reacción.
- Con una pipeta de 12 canales, mezcle los pocillos de la fila H y coloque 10 μL de la mezcla de reacción en la parte inferior de una placa LBA. Incline inmediatamente la placa y deje que los puntos se extiendan por ~ 1,5-2 cm. Repita este procedimiento para las filas G, F y E, ubicándolas por encima de la fila anterior en la placa LBA. Las filas E, F, G y H se ven en una placa LBA y las filas A, B, C y D se ven en una segunda placa LBA de la misma manera, consulte la Figura 1.
- Incubar las placas de LBA a temperatura ambiente hasta que la solución se adsorba en las placas de LBA (10-15 min). Coloque las tapas en las placas de LBA y coloque las placas de LBA en la incubadora microbiológica boca abajo para incubar durante la noche (~16-18 h). Incubar Shigella flexneri 2a y 3a a 29 °C e incubar S. sonnei a 26 °C.
nota: Estas temperaturas producen "microcolonias" más pequeñas con tamaños adecuados para un conteo preciso por un contador de colonias9.
- Después de la incubación durante la noche, agregue 25 mL de agar Overlay (a ~55 °C) que contenga 100 μg/mL de TTC y 0.1% de NaN3 a cada placa de LBA.
- Incubar las placas de LBA a 37 °C durante 2 h para permitir que las bacterias supervivientes desarrollen un color rojo, véase la figura 1 a continuación.
- Fotografíe las placas con una cámara digital y transfiera las imágenes a una computadora donde se haya instalado el Software de Enumeración de Colonias Integradas (NICE) del NIST, consulte la Figura 2.
nota: El software de conteo de colonias NICE está disponible sin cargo. Consulte la Lista de materiales para obtener detalles e instrucciones de instalación.
Tabla 1: Disposición de la placa de ensayo. Las columnas 1 y 2 contienen los pozos de control del complemento. El control A se encuentra en la columna 1 y es el control del complemento inactivado por calor, que contiene tampón SBA, bacterias y complemento inactivado por calor. El control B se encuentra en la columna 2 y es el control activo del complemento, que contiene tampón SBA, bacterias y complemento. Las columnas 3 a 12 contienen muestras de suero. Cada muestra se procesa por duplicado y se diluye en serie 3 veces desde la fila H hasta la fila A
| 1 | número arábigo | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| un | Control A | Control B | Dilución 8 | Dilución 8 | Dilución 8 | Dilución 8 | Dilución 8 | Dilución 8 | Dilución 8 | Dilución 8 | Dilución 8 | Dilución 8 |
| B | Control A | Control B | Dilución 7 | Dilución 7 | Dilución 7 | Dilución 7 | Dilución 7 | Dilución 7 | Dilución 7 | Dilución 7 | Dilución 7 | Dilución 7 |
| C | Control A | Control B | Dilución 6 | Dilución 6 | Dilución 6 | Dilución 6 | Dilución 6 | Dilución 6 | Dilución 6 | Dilución 6 | Dilución 6 | Dilución 6 |
| D | Control A | Control B | Dilución 5 | Dilución 5 | Dilución 5 | Dilución 5 | Dilución 5 | Dilución 5 | Dilución 5 | Dilución 5 | Dilución 5 | Dilución 5 |
| E | Control A | Control B | Dilución 4 | Dilución 4 | Dilución 4 | Dilución 4 | Dilución 4 | Dilución 4 | Dilución 4 | Dilución 4 | Dilución 4 | Dilución 4 |
| F | Control A | Control B | Dilución 3 | Dilución 3 | Dilución 3 | Dilución 3 | Dilución 3 | Dilución 3 | Dilución 3 | Dilución 3 | Dilución 3 | Dilución 3 |
| G | Control A | Control B | Dilución 2 | Dilución 2 | Dilución 2 | Dilución 2 | Dilución 2 | Dilución 2 | Dilución 2 | Dilución 2 | Dilución 2 | Dilución 2 |
| H | Control A | Control B | Dilución 1 | Dilución 1 | Dilución 1 | Dilución 1 | Dilución 1 | Dilución 1 | Dilución 1 | Dilución 1 | Dilución 1 | Dilución 1 |
| | | Ejemplo 1 | Ejemplo 2 | Ejemplo 3 | Ejemplo 4 | Ejemplo 5 |
