$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
>1. Preparación de timocitos apoptóticos marcados con CFSE
- Eutanasiar a dos ratones C57/B6 ingenuos por inhalación de CO2 durante 10 minutos y diseccionar para abrir la cavidad torácica, extraer (extraer) el timo con pinzas curvas de punta fina en una placa de Petri de cultivo de tejidos que contenga 10 ml de medio RPMI1640.
- Obtenga la suspensión unicelular triturando todo el timo contra dos extremos esmerilados de los portaobjetos del microscopio y luego filtre la suspensión a través de un filtro celular de 100 μm.
- Recoja la suspensión de timo de 10 ml en un tubo de 50 ml y centrifugue a 300 x g durante 5 minutos.
- Retire el sobrenadante, vuelva a suspender en 40 mL de 1x PBS y cuente el número de células con un hemocitómetro.
- Centrifugar a 300 x g durante 5 min y retirar el sobrenadante.
- Vuelva a suspender en 20 mL de 1x PBS en un tubo de 50 mL como una suspensión de una sola celda con hasta 2 x 108 celdas (si hay más de 2 x 108 celdas, resuspenda el resto de las celdas en otros 20 mL de 1 x PBS en un tubo diferente de 50 mL).
- Haga 5 μM de CFSE en un volumen igual (20 mL) de 1x PBS en un tubo separado de 50 mL pipeteando 40 μL de solución madre de CFSE (2,5 mM) en 20 mL de 1x PBS y mezcle bien invirtiendo el tubo 2 - 3 veces.
- Agregue los 20 mL de CFSE del paso 1.7 a los 20 mL de suspensión celular del paso 1.6 (la concentración final de CFSE ahora es de 2.5 μM).
nota: Por cada 20 mL de suspensión celular, se necesita un tubo CFSE de 20 mL.
- Invierta la célula y el tubo de mezcla CFSE 2 o 3 veces e incube la mezcla en la oscuridad a temperatura ambiente durante un máximo de 2 minutos, luego detenga la reacción agregando 10 ml de suero de caballo inactivado por calor.
- Centrifugar la mezcla de tubo de 50 mL a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
nota: Si el etiquetado CFSE es exitoso, el pellet de celda se volverá de color amarillo claro.
- Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de células en 40 mL de 1x PBS y cuente el número de células con un hemocitómetro.
- Centrifugar la suspensión celular a 300 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante.
- Lavar de nuevo el pellet celular con 40 mL de medio RPMI1640.
- Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células con RPMI1640 medio de cultivo de tejidos (RPMI1640, 20 mM de HEPES, 10% de FBS (inactivado por calor), 20 mM de glutamina y 1x Pen/Strep) a una concentración de 7 x 106 células/mL en una placa de cultivo de tejidos de 100 mm.
nota: Si se obtienen más células, se necesitará una placa de cultivo de tejidos separada de 100 mm.
- Añadir estaurosporina al cultivo en suspensión celular a una concentración final de 1 μM y cultivar durante 4 h a 37 °C en una incubadora de cultivo de tejidos suministrada con 5% de CO2.
>2. Preparación de macrófagos peritoneales
- Inyecte a dos ratones C57B6 (o cualquier ratón manipulado genéticamente en el laboratorio) por vía intraperitoneal 1 ml de tioglicolato envejecido al 3% en el día 0.
- Eutanasiar a los ratones el día 5 como en el paso 1.1, cortar y pelar la piel abdominal pero dejar el peritoneo intacto. Enjuague la cavidad peritoneal empujando rápidamente 10 mL de tampón de lavado (RPMI1640, 2% FBS, 0,04% EDTA) en la cavidad peritoneal utilizando una jeringa de 10 mL conectada a una aguja de 18 G.
- Recupere el tampón de lavado lentamente con la misma aguja/jeringa y recoja el tampón de lavado en un tubo de 50 ml.
- Lave la sonda peritoneal dos veces con 1x PBS, vuelva a suspender los macrófagos peritoneales en RPMI1640 medio de cultivo de tejidos a una densidad de 2 x 106 células/mL y alícuota 500 μL en cada pocillo de la placa de 24 pocillos. Deje la placa en una incubadora de cultivo de tejidos durante 2 h.
- Retire las células flotantes aspirándolas y sustituyéndolas por 500 μL de medio de cultivo fresco, dos veces.
- Opcionalmente, agregue el inhibidor de tirosina del receptor TAM, RXDX-106, a las concentraciones indicadas en las leyendas de la figura en cada pocillo del cultivo de macrófagos e incube durante otras 2 h.
>3. Cocultivo de macrófagos peritoneales con timocitos apoptóticos
- Recoja los timocitos apoptóticos del paso 1 y lávese tres veces con RPMI1640 medio. La eficiencia de la inducción apoptótica se puede medir en esta etapa con el kit Annexin V/7-AAD.
- Distribuya de 0 a 12 x 106 células (en medio de 500 μL) en cada pocillo de los cultivos de macrófagos del protocolo #2, de acuerdo con el arreglo experimental (por ejemplo, ver Figura 1). Esto hace que el volumen total de cultivo sea de 1 mL en cada pocillo de la placa de 24 pocillos. Añadir el anticuerpo bloqueante en el cultivo inmediatamente antes de la adición de timocitos apoptóticos.
- Cultivo de la mezcla celular a 37 °C durante 4 h en una incubadora de cultivo de tejidos suministrada con 5% deCO2.
- Lave cada pocillo del cultivo con 1x PBS (que contiene 500 μM de EDTA) dos veces para eliminar las células apoptóticas que flotan libremente.
- Tiñir los macrófagos unidos a la placa con CD11b-PE en esta etapa.
- Lave los macrófagos unidos a la placa con un tampón de tinción (1x PBS, 1% BSA) una vez.
- Agregue 200 μL de tampón de tinción que contenga 2 μL de CD11b-PE en cada pocillo.
- Incubar la placa a 4 °C durante 20 min.
- Lave cada pocillo de la placa tres veces con el tampón para manchas.
- Añada 200 μL de tampón de tinción y proceda con la placa para el análisis de imágenes bajo el microscopio fluorescente.
