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1. Polarización de HMDM
- En condiciones estériles, prepare el medio de cebado M1 añadiendo interferón γ (IFNγ; 20 ng/mL) y lipopolisacárido (LPS; 1 μg/mL) al medio de cultivo RPMI-1640 completo. Prepare el medio de cebado M2 agregando interleucina 4 (IL-4; 20 ng/mL) al medio de cultivo RPMI-1640 completo.
- En condiciones estériles, aspire los medios de los pocillos en placa de cultivo de tejidos que contengan los macrófagos derivados de monocitos humanos, HMDM, que se han sembrado y cultivado como se describe en la sección 1.
- Lave cuidadosamente los pocillos que contienen las células 3 veces con PBS estéril (precalentado a 37 °C), utilizando alícuotas de 1 mL de PBS.
- Agregue 1 mL del medio de cebado M1 o M2 a cada pocillo que contenga el HMDM (lo que sea apropiado para el experimento).
- Incubar las células durante 48 h a 37 °C en presencia de 5% de CO2 en una incubadora de células.
>2. Estimulación de HMDM para inducir la liberación de MET
- En condiciones estériles, prepare los medios de cultivo que contienen diferentes estimuladores de la liberación de MET de las trampas extracelulares de macrófagos (lo que sea apropiado para el experimento) en el medio RPMI-1640 completo: PMA (25 nM), TNFα recombinante humano (25 ng/mL) o IL-8 recombinante humana (50 ng/mL).
- Para experimentos con ácido hipocloroso, estimulación con HOCl, prepare HOCl (200 μM) en HBSS (precalentado a 37 °C), inmediatamente antes de la adición a las células. Asegúrese de que el HOCl no se prepare en un medio celular completo.
nota: La concentración de la solución madre de HOCl se cuantifica midiendo la absorbancia UV de la solución a 292 nm y pH = 116 y utilizando un coeficiente de extinción de 350 M-1 cm-1.
- Después del tratamiento de polarización descrito en la sección 2, aspire los medios celulares de cada pocillo y lave cuidadosamente las células 3 veces con alícuotas de 1 mL de: PBS estéril (para PMA, TNFα e IL-8) o HBSS (para HOCl), que se han precalentado a 37 °C.
- Para experimentos con PMA, TNFα o IL-8: agregue 1 mL del medio completo que contenga PMA, TNFα o IL-8 después de eliminar el PBS en el paso de lavado final.
- Para experimentos con TNFα, incubar las células durante 6 h a 37 °C en presencia de 5% de CO2 en una incubadora de células. Para experimentos con PMA e IL-8, incubar las células durante 24 h a 37 °C en presencia de 5% de CO2 en una incubadora de células.
- Para experimentos con HOCl, agregue 1 mL de HOCl en HBSS después de eliminar el HBSS en el paso de lavado final. A continuación, incubar las células durante 15 minutos a 37 °C en presencia de 5% de CO2 en una incubadora de células.
- Aspire cuidadosamente el sobrenadante celular y lave las células 3 veces con alícuotas de 1 mL de HBSS como se describe en el paso 2.3.
- Después de retirar el HBSS del paso de lavado final, agregue 1 mL de medio de cultivo RPMI-1640 completo. A continuación, incubar las células durante 24 h a 37 °C en presencia de un 5% de CO2 en una incubadora de células.
>3. Visualización de MET en cultivo de células vivas
- Prepare el colorante verde SYTOX en HBSS a una concentración de 40 μM.
- Al final de los tratamientos descritos en la sección 2 para inducir la liberación de MET, añadir directamente 25 μL de 40 μM del colorante a cada pocillo que contenga HMDM.
- Incubar las células a temperatura ambiente (RT) durante 5 minutos en la oscuridad.
- Coloque el HMDM en pocillos de cultivo de tejidos en la platina del microscopio de un microscopio fluorescente invertido para la obtención de imágenes.
- Procedimientos microscópicos
- Encienda una fuente de luz fluorescente de amplio espectro, una fuente de luz de campo claro y un microscopio invertido instalados con una cámara digital a color de alta resolución (consulte la Tabla de materiales).
- Gire la rueda de filtros a la posición "número 2" para fluorescencia verde (excitación = 504 nm, emisión = 523 nm) para obtener imágenes de las muestras teñidas de verde contenidas dentro de los pocillos de cultivo de tejidos.
- Con el objetivo 5x, enfoque la imagen con el enfoque grueso y, a continuación, con las perillas de enfoque fino del microscopio, hasta que la imagen aparezca nítida, clara y enfocada cuando se vea a través del ocular del microscopio.
- Cambie el microscopio al modo de cámara.
- Inicie el software asociado.
- Seleccione la pestaña Capturar en el software.
- Haga clic en el botón Reproducir para obtener una vista previa de la imagen y ajuste la perilla de enfoque fino en el microscopio hasta que la imagen aparezca nítida, clara y enfocada en la ventana de vista previa del software.
- Haga clic en el botón Capturar.
nota: La imagen capturada se mostrará automáticamente en el software adjunto.
- Dentro del software, haga clic en Archivo | Guardar como el tipo de archivo de imagen requerido.
- En el microscopio, gire la rueda de filtros a la posición "número 5" para obtener imágenes de campo claro y repita los pasos 3.5.2 a 3.5.9 para obtener la imagen de campo claro correspondiente.
- Repita los pasos 3.5.2 a 3.5.10 según sea necesario para la adquisición posterior de la imagen.