Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.
>1. Purificación de leucocitos polimorfonucleares humanos y aislamiento de suero humano
NOTA: Todos los reactivos deben ser revisados rutinariamente para detectar la presencia de endotoxinas utilizando un kit de detección de endotoxinas disponible comercialmente y deben contener <25.0 pg/mL de endotoxina para prevenir el cebado no deseado de PMN.
- Lleve 50 mL de NaCl al 3% de dextrano-0.9% NaCl (p/v), 35 mL de NaCl al 0.9% (p/v), 20 mL de NaCl (p/v) al 1.8%, 12 mL de solución de gradiente de densidad de 1.077 g/mL y 20 mL de agua de grado de inyección o irrigación a temperatura ambiente.
- Para aislar el suero humano, incubar 4 mL de sangre humana recién extraída sin anticoagulante a 37 °C en un tubo de vidrio de 15 mL durante 30 min. Después de la incubación, centrifugar la muestra a 2.000-3.000 × g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Transfiera la capa superior de suero a un tubo de centrífuga cónico nuevo de 15 ml y colóquelo en hielo.
- Combine 25 mL de sangre humana entera heparinizada recién extraída (1000 unidades/mL) con 25 mL de dextrano al 3% dextrano y 0,9% NaCl a temperatura ambiente (proporción 1:1) en dos tubos de centrífuga cónicos de 50 mL replicados (50 mL de volumen total por tubo). Mezcle meciendo suavemente cada tubo cónico de 50 ml y luego deje reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
- Después de la incubación a temperatura ambiente, aparecerán dos capas separadas. Transfiera la capa superior de cada mezcla de dextrano y sangre a nuevos tubos cónicos de 50 ml y centrifugue a 450 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente con frenos bajos o sin frenos.
- Aspire cuidadosamente ambos sobrenadantes y deséchelos sin alterar los gránulos de celdas. Vuelva a suspender suavemente cada gránulo celular en 2 mL de NaCl al 0,9 % a temperatura ambiente, combine los gránulos resuspendidos en un solo tubo cónico de 50 mL, luego agregue el 0,9 % de NaCl restante (volumen final de 35 mL).
- Aplique cuidadosamente 10 mL de solución de gradiente de densidad a temperatura ambiente de 1,077 g/mL debajo de la suspensión celular con una pipeta manual. Centrifugar a 450 x g durante 30 minutos a temperatura ambiente con frenos bajos o sin frenos. Aspire suavemente el sobrenadante sin alterar el pellet de la célula. El sobrenadante contendrá células mononucleares de sangre periférica que se pueden recolectar como se describió anteriormente.
- Lisar los glóbulos rojos resuspendiendo la pastilla celular en 20 ml de agua a temperatura ambiente. Mezcle suavemente balanceando el tubo durante 30 segundos. La lisis de los glóbulos rojos se acompañará de una clara disminución de la turbidez.
- Añadir inmediatamente 20 mL de NaCl al 1,8% (a temperatura ambiente [RT]) y centrifugar la muestra a 450 × g durante 10 min a temperatura ambiente><.
nota: Es importante minimizar el tiempo que las PMN se dejan solas en el agua después de la lisis de los glóbulos rojos para maximizar el rendimiento de PMN y prevenir la lisis y/o activación de las PMN.
- Aspire cuidadosamente el sobrenadante sin alterar la pellet de la célula. Vuelva a suspender suavemente el pellet celular en 2 mL de medio RT RPMI 1640 y colóquelo sobre hielo.
- Cuente las células con un hemocitómetro. Vuelva a suspender las PMN purificadas a una concentración de 1 x 107 células/ml con RPMI helada y manténgalas en hielo.
- Combine 100 μL de PMN purificadas (1 x 106 celdas) con 300 μL de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) helada que contiene 1 μL de tinción de yoduro de propidio en dos tubos de citometría de flujo replicados. Para un control positivo del daño de la membrana plasmática, agregue 40 μL de solución Triton X-100 al 0,5% en uno de los tubos de citometría de flujo y mezcle bien.
- Utilice la citometría de flujo para medir la dispersión directa, la dispersión lateral y la tinción de yoduro de propidio (máximos de excitación/emisión a 535/617 nm) de las células purificadas (Figura 1).
nota: El análisis de dispersión frontal y lateral identificará poblaciones no deseadas de linfocitos y monocitos. El yoduro de propidio solo tiñirá las células con una membrana plasmática comprometida y no se deben utilizar PMN purificadas que tengan poblaciones pronunciadas de células positivas para el yoduro de propidio. Para estos estudios, solo se utilizaron PMN purificadas si comprendían el >98% de las células purificadas y el <5% tenían un resultado positivo para yoduro de propidio.
- Prepare una placa de 96 pocillos para los ensayos de citotoxicidad de PMN recubriendo los pocillos individuales que se utilizarán en este ensayo con 100 μL de suero humano aislado al 20% que se ha diluido con DPBS.
nota: El recubrimiento de PMN directamente sobre plástico o vidrio provocará la activación de las células. Asegúrese de incluir al menos un pocillo de control negativo que solo recibirá medios y al menos un pocillo de control positivo que recibirá Triton X-100 al 0,05 %.
- Incubar la placa a 37 °C durante 30 min. Después de la incubación, lave los pocillos recubiertos dos veces con DPBS helado para eliminar el exceso de suero. Golpee suavemente la placa boca abajo para eliminar cualquier DPBS residual y colóquela sobre hielo.
- Agregue suavemente 100 μL de PMN humano purificado a 1 x 107 células/mL a cada pocillo recubierto (1 x 106 PMN/pocillo). Permita que los PMN se asienten en los pozos incubando la placa en hielo durante al menos 5 minutos. Mantenga la placa nivelada para permitir una distribución uniforme de las células en cada pocillo y déjela en hielo para evitar la activación no deseada de PMN.
>2. Ensayo de citotoxicidad de proteínas extracelulares de S. aureus frente a leucocitos polimorfonucleares humanos
- Cultivo de S. aureus durante la noche en caldo de soja tríptico (TSB) utilizando una incubadora agitadora a 37 °C. Para estos estudios, se inocularon 20 mL de TSB en matraces Erlenmeyer separados de 150 mL con cultivos congelados de las cepas de S. aureus USA300 o USA300ΔsaeR/S y se cultivaron durante aproximadamente 14 h con agitación a 250 rpm.
- Subcultivo de S. aureus mediante la realización de una dilución 1:100 de cultivo bacteriano durante la noche con medios frescos. Incubar a 37 °C con agitación hasta que las bacterias alcancen la fase temprana de crecimiento estacionario.
nota: Para estos experimentos, se inocularon 20 mL de caldo de soja tríptico en matraces Erlenmeyer de 150 mL con 200 μL de USA300 o USA300ΔsaeR/S cultivados durante la noche y se incubaron a 37 °C con agitación a 250 rpm durante 5 h.
- Cuando las bacterias hayan alcanzado la fase temprana de crecimiento estacionario, transfiera 1 mL de S. aureus subcultivado a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y centrifugue a 5.000 × g durante 5 min a temperatura ambiente.
- Después de la centrifugación, transfiera el sobrenadante a una jeringa de 3 ml. Pase los sobrenadantes a través de un filtro de 0,22 μm y dentro de un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL en hielo.
- Realizar diluciones seriadas de sobrenadantes con medios helados utilizados para cultivar S. aureus.
nota: Para los experimentos mostrados, los sobrenadantes de USA300 y USA300ΔsaeR/S se sometieron a cuatro diluciones consecutivas de 1/2 log con TSB helado.
- Agregue suavemente muestras de sobrenadante o medios solos (para controles negativos y positivos) a pocillos individuales de placas de 96 pocillos que contengan PMN en hielo a partir del paso 1.15. Para estos experimentos, se añadieron 10 μL de muestras de sobrenadante USA300 o USA300ΔsaeR/S a cada pocillo. Placa de roca suave para distribuir sobrenadantes en pocillos e incubar a 37 °C.
- En los momentos deseados, retire la placa de la incubadora y colóquela sobre hielo. Añada 40 μL de Triton X-100 al 0,5% al pocillo de control positivo.
- Pipetear suavemente las muestras hacia arriba y hacia abajo en cada pocillo para extraer completamente todos los PMN adheridos a la placa, luego transfiera las muestras a tubos de citometría de flujo en hielo que contengan 300 μL de DPBS helado con 1 μL de yoduro de propidio.
- Mida la proporción de PMN positivas para yoduro de propidio mediante citometría de flujo (Figura 2A). Cuando se une al ADN, el yoduro de propidio tiene excitación/emisión a 535/617 nm.
