Ensayo de citotoxicidad de cepas de Staphylococcus aureus en neutrófilos después de fagocitosis

Resumen

Fuente: Dankoff, J. G. et al., Cuantificación de la citotoxicidad de Staphylococcus aureus contra leucocitos polimorfonucleares humanos. J. Vis. Exp. (2020)

En este vídeo, demostramos un ensayo para detectar la citotoxicidad de cepas de S. taphylococcus aureus virulentas y menos virulentas frente a neutrófilos humanos después de la fagocitosis utilizando citometría de flujo.

Protocolo

1. Ensayo de citotoxicidad de S. aureus contra leucocitos polimorfonucleares humanos después de la fagocitosis

NOTA: Las curvas de crecimiento definidas por la densidad óptica a 600 nm (OD600) y la concentración de bacterias deben determinarse empíricamente para que las cepas de S. aureus se analicen antes de comenzar este ensayo. El éxito de estos experimentos requiere la cosecha constante de concentraciones iguales de cada cepa de S. aureus probada en la fase de crecimiento exponencial medio utilizando el OD600 de bacterias subcultivadas.

1. Comience los cultivos nocturnos de cepas de S. aureus y subcultivos de bacterias como se describe a continuación.
   1. Cultivo de S. aureus durante la noche en caldo de soja tríptico (TSB) utilizando una incubadora agitadora a 37 °C. Para estos estudios, se inocularon 20 mL de TSB en matraces Erlenmeyer separados de 150 mL con cultivos congelados de las cepas USA300 o USA300ΔsaeR/S de S. aureus y se cultivaron durante aproximadamente 14 h con agitación a 250 rpm.
   2. Subcultivo de S. aureus mediante la realización de una dilución 1:100 de cultivo bacteriano durante la noche con medios frescos. Incubar a 37 °C con agitación.
2. Coseche el S. aureus subcultivado cuando haya alcanzado un crecimiento exponencial medio transfiriendo 1 mL de bacterias cultivadas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y centrifugando a 5.000 × g durante 5 min a temperatura ambiente><. nota: Bajo nuestras condiciones de crecimiento, USA300 y USA300ΔsaeR/S alcanzaron la fase de crecimiento exponencial medio después de aproximadamente 135 min de incubación.
3. Lavar S. aureus después de la centrifugación aspirando el sobrenadante, resuspendiendo las bacterias peletizadas en 1 mL de DPBS, vórtice la muestra durante 30 s y centrifugando a 5.000 × g durante 5 min a temperatura ambiente.
4. Opsonizar S. aureus resuspendiendo el pellet bacteriano en 1 mL de suero humano al 20% diluido con DPBS e incubando a 37 °C con agitación durante 15 min.
5. Centrifugar bacterias opsonizadas a 5.000 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Lave el S. aureus después de la centrifugación aspirando el sobrenadante, resuspendiendo las bacterias granuladas en 1 mL de DPBS y luego agitando la muestra en vórtice hasta que la gránula bacteriana se rompa por completo más 30 segundos adicionales. Centrifugar las bacterias a 5.000 × g durante 5 min a temperatura ambiente.
6. Vuelva a suspender las cepas de S. aureus opsonizadas en 1 mL RPMI, agite la muestra hasta que la pastilla bacteriana se rompa por completo y luego durante 30 s adicionales. Coloque las bacterias en hielo.
7. Diluya las cepas de S. aureus opsonizadas hasta la concentración deseada con RPMI helado. Vórtice durante 30 s y colóquelo en hielo.
8. Confirme la concentración de S. aureus opsonizado mediante la siembra de diluciones seriadas de bacterias 1:10 en agar de soja tríptico.
   nota: Debido a que las diferencias en la concentración de bacterias utilizadas en este ensayo pueden tener un impacto importante en la permeabilidad posterior de la membrana plasmática de PMN (Figura 1A), es esencial que la concentración de cada cepa probada se determine para cada experimento y sea equivalente entre cepas.
9. Agregue suavemente 100 μL/pocillo de cada cepa de S. aureus o RPMI (para controles positivos y negativos) a las PMN en la placa de 96 pocillos en hielo. Placa de roca suave para distribuir S. aureus en pozos.
10. Sincronice la fagocitosis centrifugando la placa a 500 × g durante 8 min a 4 °C. Incube la placa a 37 °C inmediatamente después de la centrifugación (T = 0).
11. En los momentos deseados, retire la placa de la incubadora y colóquela sobre hielo. Añada 40 μL de Triton X-100 al 0,5% al pocillo de control positivo.
12. Pipetear suavemente las muestras hacia arriba y hacia abajo en cada pocillo para extraer completamente todos los PMN adheridos a la placa, luego transfiera las muestras a tubos de citometría de flujo en hielo que contengan 200 μL de DPBS helado con 1 μL de yoduro de propidio.
13. Analice las muestras para la tinción con yoduro de propidio mediante citometría de flujo.
14. Mida la proporción de PMN positivos para yoduro de propidio mediante citometría de flujo. Cuando se une al ADN, el yoduro de propidio tiene excitación/emisión a 535/617 nm.

Resultados

Figura 1: Análisis por citometría de flujo de PMNs tras fagocitosis de S. aureus. (A) La proporción de PMNs positivos para yoduro de propidio 90 min después de la fagocitosis de diferentes concentraciones de USA300 o USA300∆saeR/S. (B) La concentración de cepas de S. aureus opsonizadas utilizadas para los experimentos se muestra en el panel A. Los datos se p...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL con tapones a presión	VWR	89000-044	Se utiliza en el lavado de células
Tubos de cultivo de 12x75mm	VWR	60818-430	Utilizados como tubos de citometría de flujo
Tubos de centrífuga cónicos de 50 mL	VWR	89039-656	Para dosificar medios
Caldo de soja tríptico Bacto, medio de digestión de soja-caseína	FischerCientífico	211823	Para el cultivo de células
Hemocitómetro Bright-Line	Sigma-Aldrich	Z359629	Aparato de recuento de células
DPBS, 1x (solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco) con calcio y magnesio	Corning	21-030-CV	Se utiliza en el lavado de células
Ficoll-Paque PLUS	GE Cuidado de la Salud	17-1440-02	Purificación de PMN
Fisherbrand Pipetas serológicas desechables de poliestireno estéril	FischerCientífico	13-678-11E	Para aspirar líquido
Placas de pocillos Greiner CELLSTAR de 96	Millipore Sigma	M0687	Placa para la sujeción de muestras experimentales
Filtros de jeringa OMICRON	Ómicron Científico	SFPV13R	Para el filtrado de sobrenadantes
Yoduro de propidio	ThermoFisher Scientific	P3566	Tinción de ADN impermeable a la membrana
Frascos Erlenmeyer de la marca PYREX 4980	Cole-Parmer	EW-34503-24	Para el cultivo de células
RPMI 1640, 1X sin L-glutamina, rojo fenol	Corning	17-105-CV	Se utiliza en la resuspensión de células
Tritón X-100	Sigma-Aldrich	X100	Control positivo de la integridad de la membrana