Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Cepas y condiciones de cultivo
Nota: La cepa de M. tuberculosis CDC1551 se utiliza en este estudio, pero cualquier cepa de M. tuberculosis se puede utilizar de la misma manera.
- Cultive las bacterias en un medio M-OADC-TW (caldo 7H9 suplementado con 0,5% de glicerol, 10% de ácido oleico dextrosa sin catalasa y 0,05% de Tween-80) a 37 °C a un OD600 de 0,5 (~ 0,2 x 107 unidades formadoras de colonias o UFC).
- Diluir el cultivo en M-OADC-TW (serie de diluciones 1:10 de las bacterias). Coloque las diluciones de las bacterias (105, 106, 107, 108) por triplicado en placas selectivas 7H11 para permitir la determinación de UFC.
- Incubar las placas durante cuatro semanas a 37 °C o hasta que las colonias se puedan contar con precisión.
- Centrifugar el inóculo bacteriano a 8.534 x g durante 5 min para obtener un pellet. Lavar el pellet una vez con 10 mL de solución salina (0,9% NaCl) y volver a suspender el pellet en 15 mL de solución salina (0,9% NaCl).
>2. Infección por aerosol de ratones usando una cámara de Madison
- Permita que los ratones se aclimaten al nuevo entorno durante una semana.
- Pesa los ratones antes de cargarlos en la cámara.
- Conecte tres cables a la regleta de enchufes: la alimentación de la cámara principal, la bomba de vacío y el compresor de aire, en ese orden.
- Desenrosque con cuidado el frasco de vidrio. Lleve el frasco de vidrio a la cabina de bioseguridad y agregue el inóculo de desafío suspendido en 15 mL de solución salina (0.9% NaCl) para lograr ~ 104 - 106 UFC de bacterias en los pulmones.
- Cierre la tapa del frasco de vidrio en el gabinete de bioseguridad. Conecte el frasco a la unidad nebulizadora y ajuste el tubo vertical de acero inoxidable de modo que el extremo inferior (de entrada) esté aproximadamente un cuarto de pulgada por debajo del nivel del fluido en el frasco.
- Cargue todos los animales necesarios para el experimento (la cámara puede contener hasta 90 ratones) en la cámara y cierre todos los pestillos de la puerta.
- Revise el medidor de flujo de aire principal (de la habitación). Asegúrese de que el centro del flotador (bola) funcione a unos 50 L/min medido en la escala de la izquierda.
- Presione el botón de inicio en el panel de control de la cámara. Ajuste el caudal de aire a través del caudalímetro de aire del compresor (el medidor más pequeño de la izquierda) a 4 L/min en la báscula. Verifique visualmente para asegurarse de que el inóculo de desafío se esté nebulizando.
- Después de 15 minutos, cuando aparezca la luz roja en la parte frontal del panel de control y una señal audible indique el final de la ejecución, presione el botón Restablecer en la esquina inferior derecha del panel de control para restablecer los temporizadores.
- Mantenga presionado el pequeño botón rojo en la puerta de la cámara para liberar el vacío.
- Abra la puerta de la cámara y retire a los animales. Vuelve a colocar a los ratones en sus jaulas.
- Retire el frasco de vidrio del nebulizador y colóquelo en un recipiente de transporte sellado a prueba de fugas. Coloque el contenedor dentro del gabinete de bioseguridad y deseche la suspensión de desafío en un contenedor de desechos designado.
- Coloque el frasco de nebulizador usado dentro de una bolsa de riesgo biológico y selle la bolsa para transportarla al autoclave.
- Al final del procedimiento de infección, rocíe el interior de la cámara con fenol tamponado y etanol al 70% y deje reposar la cámara durante 10 minutos.
- A continuación, limpie muy a fondo todas las superficies interiores accesibles. Deseche todas las toallas de papel contaminadas, etc. en la basura de riesgo biológico. Esteriliza en autoclave la basura, los contenedores de residuos y los frascos de nebulizador usados.
- Vuelva a colocar a los animales en la sala de contención hasta el momento de la toma de imágenes.
- El día de la toma de imágenes, transfiera a los animales en un contenedor secundario a la sala de imágenes.
>3. Anestesia animal
- Anestesiar a los ratones con isoflurano utilizando un sistema de anestesia gaseosa personalizado.
- Pese cada uno de los dos recipientes de filtro de carbón ubicados en la parte superior de la unidad de anestesia.
- Reemplácelo por un nuevo recipiente si el peso es 50 g superior al peso inicial.
- Revise la unidad del vaporizador para asegurarse de que haya suficiente isoflurano para el procedimiento.
- Coloque el soporte del cono de la nariz dentro de la cámara de imágenes. Coloque la cantidad de conos nasales necesarios para el procedimiento y selle las aberturas restantes con los bloqueadores de conos nasales.
- Abra el suministro de oxígeno del cilindro de alta presión y ajústelo a 55 psi.
- Encienda la bomba de evacuación situada delante de la unidad de anestesia y ajústela a 8 L/min.
- Encienda la palanca de oxígeno ubicada frente a la unidad de anestesia.
- Abra el flujo de gas a la cámara de inducción de anestesia para ajustar el flujo de gas a 1,5 L/min. Cierre el flujo de gas.
- Abra el flujo de gas a la cámara de imágenes para ajustar el flujo de gas a 0,25 L/min. Apague el flujo de gas.
- Encienda el vaporizador de isoflurano y ajústelo a 2 - 2.5%. Ajuste el nivel de isoflurano de acuerdo con el número y el peso de los animales que se utilizan para el experimento girando el dial del vaporizador de isoflurano (2 - 2,5% para un ratón que pesa ~20 g; 4% para un conejillo de indias que pesa 300 g).
- Coloque los ratones en la cámara de anestesia y cierre la tapa. Abra el flujo de gas a la cámara de inducción de anestesia.
- Deje a los ratones en la cámara de inducción de anestesia durante 5 a 10 minutos hasta que estén completamente anestesiados.
- Una vez que los ratones estén anestesiados, aplique un ungüento óptico a los ojos para protegerlos mientras toman las imágenes.
- Coloque a los ratones en decúbito ventral o esternal, de modo que sus narices se coloquen en el cono de la nariz para facilitar la anestesia de los ratones durante el procedimiento de imagen.
>4. Imágenes de fluorescencia de enzimas reporteras (REF)
- Inyectar el sustrato (20 μM, 2,5 μL/g de peso) por inyección intraperitoneal tanto en los ratones infectados como en los control. Los ratones están bajo anestesia dentro de la cámara de imágenes durante menos de 1 minuto.
- Inicie el sistema de imágenes.
- Inicialice el sistema haciendo clic en Inicializar. Espere hasta que la barra de temperatura se vuelva verde.
nota: La cámara de imágenes consiste en una plataforma climatizada para mantener la temperatura corporal del animal mientras se toman las imágenes.
- Para la configuración de adquisición de imágenes, seleccione Fluorescente | Trans-iluminación para animales enteros o Epi-iluminación para tejidos pulmonares, Estructura y Superposición en el Panel de Control de Adquisición.
- Establezca el campo de visión en B para un solo ratón y el nivel de la lámpara en alto.
- Ajuste el tiempo de exposición a automático, agrupación media, 2 - 3 para el f/stop, y el filtro de excitación a 745 nm y los filtros de emisión de 780 nm a 840 nm.
- Para la configuración de la secuencia, haga clic en Configuración de la secuencia y seleccione de 9 a 12 puntos de transiluminación en el área pulmonar.
- Haga clic en Adquirir para la adquisición de imágenes.
- Vuelva a colocar el ratón en la jaula después de la toma de imágenes.
- Monitoree a los ratones hasta que estén completamente recuperados o sacrifique los ratones para cuantificar la UFC si toma imágenes en un punto temporal del experimento. Realice una puntuación de Karnofsky modificada para controlar el bienestar de los ratones después de la toma de imágenes.
