Evaluación de la virulencia de Leishmania en macrófagos cultivados

Resumen

Fuente: Sarkar, A. et al., La cuantificación del crecimiento intracelular dentro de los macrófagos es un método rápido y confiable para evaluar la virulencia de los parásitos de Leishmania.J. Vis. Exp.(2018)

Este video investiga la virulencia de Leishmania mediante el tratamiento de macrófagos con promastigotes metacíclicos, lo que resulta en la formación de amastigotes intracelulares. La confirmación de la virulencia de Leishmania se logra mediante tinción con colorante fluorescente de ácido nucleico. Este conocimiento puede contribuir al desarrollo de nuevas terapias para la leishmaniasis.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

>1. Aislamiento y diferenciación de macrófagos derivados de la médula ósea (BMM)

1. Día 0: Sacrificar 4 a 6 semanas de edad de un ratón hembra C57BL/6 o BALB/c en una cámara de CO₂ y confirmar la muerte por luxación cervical. Asegure la esterilización de las tijeras y pinzas manteniéndolas empapadas en etanol al 70%. Rocíe los guantes con etanol al 70% para permitir la manipulación estéril durante....

Resultados

Figura 1: Ilustración representativa de la infección por BMM con amastigotes axénicos virulentos (A) y promastigotes no virulentos en fase logarítmica (B) de L. amazonensis.Imágenes de inmunofluorescencia de macrófagos aislados de ratones BALB/c, 1 h y 48 h después de la infección. Los macrófagos infectados se procesaron para inmunofluorescencia como se describe en el protocolo. Las.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placa de cultivo celular de 6 pocillos	Estrella celular	657160
adenina	Acros Organics	AC147440250
Puntas de pipeta de barrera contra aerosoles (100-1000 μL)	Marca Pescadora	02-707-404
Puntas de pipeta de barrera de aerosol (20-200 μL)	Marca Pescadora	02-707-430
Puntas de pipeta de barrera contra aerosoles (2-20 μL)	Marca Pescadora	02-707-432
Cuchilla quirúrgica de acero al carbono Bard-Parker Rib-Back #10	Álamo Temblón Quirúrgico	371110
BD Luer-Lok Punta Jeringa 10 mL	Becton Dickinson (BD)	309604
Aguja BD Precisionglide, 25G	Becton Dickinson (BD)	305124
Plato de cultivo celular 35 mm x 10 mm	Estrella celular	627 160
matraz de cultivo celular	Estrella celular	660175
Cubreobjetos: círculos de 12 mm	Marca Pescadora	Teléfono 12-545-80
DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol, diclorhidrato)	Invitrogen	D1306
D-Biotina	J.T. Baker	C272-00
EDTA	Sigma Aldrich	Eds
Alcohol etílico de 200 grados	Pharmco-AAPER	111000200
Placa de Petri de poliestireno sin TC de 100 mm x 15 mm	Corning	351029
Suero Fetal Bovino	Seradigm	1500-500
Ficoll400	Sigma Aldrich	F8016
Microscopio de fluorescencia	Nikon	E200
Cabra anti-ratón IgG Texas rojo	Invitrogen	T-862
cabra anti-conejo IgG AlexaFluor488	Invitrogen	A-11034
Hemina	Industria química de Tokio Co. Ltd	H0008
HECTÁREAS (1M)	Gibco	15630-080
Diluyente Isoton II	Beckman Coulter	8546719
L-Glutamina	Géminis	400-106
Mediano 199 (10X)	Gibco	11825-015
Piruvato de Na (100 mM)	Gibco	11360-070
Paraformaldehido	Alfa Aesar	43368
Penicilina/Estreptomicina	Géminis	400-109
Solución salina tamponada con fosfato (-/-)	ThermoFisher	14200166
Tubos de centrífuga cónicos de polipropileno 15 mL	Estrella celular	188 271
Tubos de centrífuga cónicos de polipropileno 50 mL	Estrella celular	227 261
Reactivo antidecoloración ProLong Gold	ThermoFisher	P36930
Anticuerpo Lamp-1 anti-ratón rata	Banco de Hibridomas de Estudios del Desarrollo	1D4B
M-CSF humano recombinante	PeproTech	300-25
Hemocitómetro Reichert Bright-Line	Hausser Científico	Año 1492
RPMI Medio 1640 (1X)	Gibco	11875-093
Triton X-100 Surfactante	Millipore Sigma	TX1568-1
Azul de tripano	Sigma Aldrich	T8154
Tijeras delicadas, 4 1/2"	VWR	82027-582
Pinzas de disección, punta fina	VWR	82027-386
Portaobjetos de microscopio	VWR	16004-368
Contador de partículas Z1 Coulter, umbral doble	Beckman Coulter	6605699