Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
>1. Aislamiento y diferenciación de macrófagos derivados de la médula ósea (BMM)
- Día 0: Sacrificar 4 a 6 semanas de edad de un ratón hembra C57BL/6 o BALB/c en una cámara de CO2 y confirmar la muerte por luxación cervical. Asegure la esterilización de las tijeras y pinzas manteniéndolas empapadas en etanol al 70%. Rocíe los guantes con etanol al 70% para permitir la manipulación estéril durante todo el proceso de aislamiento de las células de la médula ósea.
- Asegure el ratón sacrificado a la tabla de disección sujetando sus extremidades delanteras y desinfectándolo rociándolo copiosamente con etanol al 70%.
- Haga una pequeña incisión (aproximadamente 1 cm) con unas tijeras cerca de la articulación de la cadera. Inserte con cuidado unas tijeras debajo de la piel para separar el músculo subyacente y cortar la piel alrededor de la articulación de la cadera.
nota: La tabla de disección se puede rotar para permitir un mejor acceso a la articulación de la cadera.
- Limpie cuidadosamente la piel de la pierna tirando hacia el tobillo y retirándola. Corte el pie a la altura del tobillo, teniendo mucho cuidado de cortar a la altura o por debajo de la articulación del tobillo para dejar la tibia completamente intacta.
nota: El peroné en esta etapa está suelto y se puede separar fácilmente con las pinzas.
- Localice manualmente la articulación de la cadera manipulando el fémur para identificar el punto de rotación. Use con cuidado unas tijeras para cortar la pierna por encima de la articulación de la cadera para dejar intacta la cabeza proximal del fémur.
- Retire la mayor cantidad posible de músculo y tejido conectivo de la pierna con unas tijeras. Retire cualquier resto de piel del tobillo y cualquier exceso de material óseo por encima de la articulación de la cadera.
- Coloque los huesos de la pierna limpios en un RPMI estéril del Roswell Park Memorial Institute suplementado con penicilina/estreptomicina (concentración final del 1%) en una placa de Petri con hielo.
- Repita los pasos 1.4 a 1.6 para aislar la tibia y el fémur de la otra pata trasera.
- Retire cualquier músculo y tejido conectivo restante de los huesos empapados en RPMI con pinzas esterilizadas y una cuchilla estéril # 10.
- Coloque los huesos en la tapa de la placa de Petri. Corta la tibia con cuidado con la cuchilla inmediatamente por encima de la articulación del tobillo para acceder a la médula. Retire la tibia del resto de la pierna cortando inmediatamente debajo de la articulación de la rodilla.
- Extraiga 10 mL de RPMI estéril suplementado con penicilina/estreptomicina (concentración final del 1%) en una jeringa de 10 mL y coloque una aguja de 25 G.
- Sujete la tibia firmemente con pinzas, verticalmente sobre un tubo cónico de 50 ml sobre hielo. Use la jeringa para inyectar suavemente aproximadamente 5 mL de RPMI en el extremo del hueso para enjuagar la médula ósea del otro extremo y colocarla en el tubo cónico. Enjuague la médula ósea con un total de 10 mL de RPMI hasta que el hueso se vuelva blanco.
nota: Después de un lavado completo, el hueso debe volverse blanco. De lo contrario, continúe enjuagando para extraer la médula. Es posible que sea necesario recortar el extremo distal de la tibia con la cuchilla si es demasiado estrecha para insertar la aguja.
- Corte el fémur inmediatamente por encima de la articulación de la rodilla e inmediatamente por debajo de la articulación de la cadera para exponer ambos extremos del hueso y acceder a la médula. Enrasar la médula ósea del fémur con un total de 10 mL de RPMI de la misma manera que la tibia.
- Repita los pasos de limpieza y lavado 1.6 a 1.13 con los huesos restantes y recoja las células enjuagadas de la médula ósea en un solo tubo cónico de 50 mL
nota: Si un hueso se rompe en cualquier punto durante la disección antes del lavado óseo, no use la médula de este hueso.
- Centrifugar el tubo cónico utilizado para recoger la médula ósea lavada de los cuatro huesos durante 10 min a 4 °C a 300 x g.
- Coloque 60 mL de medio BMM estéril (RPMI) con una concentración final de 20% de suero fetal bovino, FBS, 1% de penicilina/estreptomicina, 1,2 mM de Na-piruvato, 25 μg/mL de factor estimulante de colonias de macrófagos humanos (M-CSF) en un matraz de cultivo celular de 175cm2 con tapa de filtro.
- Deseche el sobrenadante después de la centrifugación y vuelva a suspender el pellet de la célula mediante un pipeteo suave hacia arriba y hacia abajo utilizando 5 mL de medio BMM del matraz.
- Transfiera la suspensión celular al matraz de cultivo y enjuague el tubo cónico dos veces con medio BMM del matraz de cultivo para garantizar la máxima recuperación celular. Asegúrese de que la suspensión celular esté completamente mezclada en un medio y distribuya 30 ml del matraz inicial de cultivo celular de 175cm2 a un segundo matraz de cultivo celular de 175cm2 con una tapa de filtro.
- Incubar ambos matraces que contengan 30 mL de suspensión celular cada uno durante la noche a 37 °C, 5% de dióxido de carbono (CO2) para permitir la separación de cualquier fibroblasto contaminante, macrófagos residentes y otras células adherentes.
- DÍA 1: Transfiera el sobrenadante que contiene células de médula ósea indiferenciadas de los matraces a placas de Petri de poliestireno no tratado con TC de 100 mm x 15 mm a aproximadamente 10 mL/placa e incube a 37 °C, 5% de CO2.Deseche los frascos.
- DÍA 3 o 4: Agregue 5 mL adicionales de medio BMM (precalentado a 37 °C) a cada placa de Petri y continúe la incubación a 37 °C, 5% de CO2.
>2. Colocación de BMMs en cubreobjetos para detectar infecciones (DÍA 7 u 8)
- Prepare placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos colocando cuatro (4) cubreobjetos de vidrio estériles de 12 mm (esterilizados en autoclave y almacenados en un recipiente de vidrio cerrado) en el fondo de cada pocillo vacío.
nota: Recoja cada cubreobjetos estéril de 12 mm con una punta de aspiración instalada en una línea de vacío. Coloque los cubreobjetos en los pocillos sin superponerse, liberándolos en la posición deseada apretando el tubo para interrumpir el vacío.
- Aspire los medios (y cualquier célula no adherente) de las placas de Petri recubiertas con macrófagos adherentes derivados de la médula ósea y enjuague suavemente las células adherentes 2 veces con solución salina tamponada estéril con fosfato de Dulbecco sin cloruro de calcio y magnesio (PBS -/-) precalentada a 37 °C.
- Añadir gota a gota 5 mL de PBS estéril 1x PBS -/- con una concentración final de 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) a cada placa de Petri e incubar durante 5 min a 37 °C para separar los BMM adherentes. Verificar que las células estén desprendidas utilizando un microscopio.
- Recoja todas las células desprendidas suspendidas en 1x PBS -/- suplementado con 1 mM de EDTA en un tubo cónico de 50 mL. Enjuague cada plato 2 veces con 5 mL de PBS -/- y agréguelo a la piscina de suspensión de celdas.
nota: La suspensión celular puede diluirse con PBS adicional -/- para proteger a los macrófagos de la toxicidad del EDTA durante el proceso de recolección.
- Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender los macrófagos en un medio BMM de 5 a 10 mL mediante pipeteo. Coloque las células resuspendidas en hielo para evitar que se adhieran a los tubos y se aglomeren.
- Recuento de células viables utilizando la exclusión de azul de tripano en el hemocitómetro.
nota: Para contar las células BMM resuspendidas en un medio de 5 mL, una mezcla de dilución de 25 μL de suspensión celular en 445 μL de PBS -/- y 30 μL de solución de azul de tripano al 0,4% suele permitir una fácil cuantificación en un hemocitómetro (teniendo en cuenta un factor de dilución de 20x para el cálculo final). Cuente solo las células que no se tiñeron con azul de tripán (células viables). El volumen de la suspensión celular puede verse alterado si esta mezcla está demasiado concentrada o diluida. En general, el rendimiento de BMM por preparación varía entre 2 x 107 y 5 x 107 celdas de un solo ratón.
- Prepare la suspensión celular en medio BMM a la concentración de recubrimiento deseada (5 x 105/mL) y disperse la suspensión en placas de 6 pocillos en medio de 2 mL por pocillo para que cada pocillo reciba 1 x 106 macrófagos.
nota: Este es un paso crítico que garantiza que cada pocillo reciba un número adecuado de macrófagos para cubrir los cubreobjetos de manera uniforme. Verifique que los cubreobjetos de los pozos no se superpongan ni floten en el medio. Si es así, ajústelo suavemente con una punta de pipeta estéril.
- Incubar durante la noche a 37 °C, 5% de CO2.
>3. Purificación de formas infecciosas de Leishmania amazonensis
NOTA: Prepare Leishmania para infecciones: purifique promastigotes metacíclicos de cultivos promastigotes estacionarios, o diferencie promastigotes en cultivo en forma de amastigote utilizando el protocolo estándar de diferenciación axénica de L. amazonensis.
- Purificación de promastigotes metacíclicos de Leishmania utilizando medios de gradiente de densidad (Materiales)
- Prepare una solución madre al 40% de medios de gradiente de densidad en agua estéril y libre de endotoxinas.
- Diluir la solución de gradiente de densidad en medio M199 10x (sin suero) para preparar una concentración del 10% en el medio M199.
- Filtre todas las soluciones a través de un filtro de 0,22 μm.
nota: Las soluciones madre pueden almacenarse a 4 °C en la oscuridad durante no más de 1 mes.
- Agregue 2 mL de solución de medio de gradiente de densidad al 40% en el fondo de un tubo de centrífuga cónico de 15 mL.
- Capa 2 mL de solución de medios de gradiente de densidad al 10% en M199 sobre la capa de medios de gradiente de densidad del 40% con cuidado, utilizando una pipeta Pasteur para evitar cualquier mezcla entre las dos capas.
- Recoja 1 x 109 parásitos de cultivo en fase estacionaria por centrifugación a 1.900 x g durante 10 min.
- Resuspenda las células en 6 mL de Medio Esencial Modificado (DMEM) de Dulbecco.
- Coloque la capa de 2 mL de la suspensión celular directamente sobre la capa de medios con gradiente de densidad del 10%, suavemente, utilizando una pipeta Pasteur para evitar la mezcla entre capas.
- Centrifugar el gradiente durante 10 min a 1.300 x g a temperatura ambiente.
nota: Debido a las diferencias en las propiedades físicas entre las especies de Leishmania, las condiciones de centrifugación de cada una podrían tener que ajustarse ligeramente para garantizar el máximo rendimiento.
- Recoja los parásitos (enriquecidos en forma de promastigote metacíclico) de la banda formada en el límite superior del medio de gradiente de densidad del 10% (interfaz entre las capas de medios de gradiente de densidad del 0% y 10%).
- Diluir los parásitos con un volumen de DMEM y recogerlos por centrifugación (1.900 x g durante 10 min a temperatura ambiente).
- Vuelva a suspender en medio DMEM de 500 μL y cuente en un hemocitómetro para cuantificar el rendimiento.
- Generación de amastigotes de L. amazonensis en condiciones de cultivo axénico (pH bajo / temperatura elevada)
- Mezclar 5 mL de cultivo de promastigote en fase logarítmica (pH 7,4 a 26 oC) con un volumen igual de medio amastigote (pH 4,5), utilizando 2 matraces de25 cm (medio total 10 mL), e incubar a 26 °C durante la noche.
- Cambie el matraz de 26 °C a 32 °C.
- Después de 3 o 4 días, dividir el cultivo 1:5 en medio amastigote a 32 °C.
- Revise los parásitos en los próximos 3 a 4 días (máximo 7 días) para ver si están listos para su uso en infecciones.
nota: Los amastigotes axénicos sanos deben tener forma ovalada, sin flagelos visibles. Los amastigotes parcialmente diferenciados tienen una gran forma ovalada con flagelos cortos. El cultivo no debe tener muchos grumos, ya que muchos de ellos son una indicación de parásitos moribundos que no crecen. El cultivo de amastigote se puede dividir 1:5 y mantener durante un máximo de 3 semanas.
>4. Infección por L. amazonensis
- Diluir las suspensiones de parásitos de acuerdo con la multiplicidad deseada de infección (MOI) (generalmente 3-5 promastigotes metacíclicos por macrófago [MOI de 1:3 o 1:5] y 1 amastigote por macrófago [MOI 1:1]). Agregue Leishmania en PBS -/- en un volumen de 50 a 100 μL a cada pocillo que ya contenga 2 mL de medio.
- Incubar BMMs durante 1 h con amastigotes y 3 h con promastigotes metacíclicos a 34 oC para infección.
nota: La temperatura óptima de infección puede variar según la especie.
- Después de la incubación, lavar a fondo los parásitos libres en cada pocillo 3 veces con 2 mL de PBS -/- precalentado a 37 °C.
nota: Disperse el PBS suavemente para asegurarse de que los cubreobjetos no floten unos sobre otros. Agite suavemente la placa y luego aspire el líquido. Use una punta de aspiración separada si usa varias cepas de parásitos para evitar la contaminación cruzada.
- Fije muestras de 1 h o 3 h incubando cada pocillo con 1,5 - 2 mL de PFA al 2% en PBS -/- durante 10 min. Lavar 3 veces con PBS -/-. No aspire las placas de último lavado y refrigere las placas que contienen cubreobjetos en PBS hasta que se manchen.
- Agregue 2 mL de medio BMM fresco a cada pocillo en placas para obtener más puntos de tiempo e incubar a 34 °C.
- Fije los puntos de tiempo restantes como desee, como se describe en el paso 4.3, y refrigere las placas hasta que se manchen.
5. Tinción de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) y montaje de cubreobjetos
- Aspire el PBS de los pocillos que contengan cubreobjetos y agregue 1,5 mL de PBS -/- con detergente no iónico al 0,1%. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente, seguido de 3 lavados con 2 mL de PBS -/-.
- Añadir 1 mL de PBS -/- con 2 μg/mL de DAPI (diluido a partir de 5 mg/mL de solución madre en agua) a los pocillos que contengan cubreobjetos e incubar durante 1 h más a temperatura ambiente><.
nota: El tiempo de incubación con DAPI es crítico para la correcta visualización de los parásitos intracelulares de Leishmania. Los núcleos de los macrófagos se tiñen rápidamente, debido a su mayor tamaño y contenido de ácido desoxirribonucleico (ADN), pero la tinción de los núcleos de los parásitos intracelulares es más lenta. Por lo tanto, es necesario extender el tiempo de incubación más allá de lo requerido para visualizar los núcleos de BMM para permitir que DAPI penetre a través de la membrana plasmática del parásito y la membrana nuclear del parásito. Con la tinción DAPI adecuada, también se puede visualizar el ADN del cinetoplasto mitocondrial cerca de la bolsa flagelar del parásito, además del ADN nuclear.
- Lave cada pocillo que contenga cubreobjetos 3 veces con 2 mL de PBS -/- y luego levante y voltee los cubreobjetos con pinzas para colocar la célula con el lado hacia abajo y montarla en portaobjetos de microscopio de vidrio con un reactivo de montaje antidecoloración disponible en el mercado.
nota: Los cubreobjetos son extremadamente frágiles y necesitan un manejo cuidadoso. Evite ejercer presión sobre ellos, especialmente contra la pared lateral de los pozos al levantarlos. La adición de unas gotas de PBS -/- reduce la tensión superficial entre el cubreobjetos y el pozo y facilita el proceso de elevación. Se puede usar una aguja de calibre fino para ayudar a sacar los cubreobjetos del fondo del pozo. Después de colocar un cubreobjetos en la guía, presione suavemente hacia abajo con pinzas para expulsar las burbujas de aire en el medio de montaje. Si un cubreobjetos está roto o posiblemente se ha volteado durante el proceso de elevación, no lo vuelva a montar; Basta con utilizar el cuarto cubreobjetos de repuesto.
- Refrigere los portaobjetos hasta la cuantificación.
6. Cuantificación de la infección
- Examine los portaobjetos teñidos con DAPI bajo un microscopio de fluorescencia enfocándose en los macrófagos utilizando una lente de objetivo de 100X con aceite de inmersión (excitación a 358 nm; emisión óptima a 461 nm).
Asegúrese de que el enfoque esté en la capa de macrófagos entre el portaobjetos de vidrio y el cubreobjetos.
- Cuantifique el número de macrófagos (núcleos grandes teñidos con DAPI) y el número de núcleos amastigotas más pequeños agrupados alrededor de cada núcleo de macrófagos (ver Figura 1A, DAPI) para cada campo de visión, utilizando un contador manual><.
nota: Es posible que los núcleos de los amastigotes no sean todos visibles en un plano de enfoque debido a su pequeño tamaño. Cuente aquellos que son visibles cuando se enfocan en los núcleos de los macrófagos y, a continuación, utilice el enfoque fino para comprobar si hay núcleos de parásitos en los planos por encima y por debajo de los núcleos de los macrófagos.
- Muévase a otro campo de visión para repetir la cuantificación. Utilice una tecla de contador independiente para realizar un seguimiento del número de campos contados. Desplácese por los campos visuales en filas paralelas a lo largo de cada cubreobjetos, para evitar la superposición de recuentos.
- Cuantificar un mínimo de 200 macrófagos por cubreobjetos. Cuantifique cada punto de tiempo de infección por triplicado (3 cubreobjetos). Cuente el cuarto cubreobjetos si uno de los anteriores no es apto para el conteo debido a superposición, mal montaje, rotura de vidrios, etc.
nota: Si no se pueden contar 200 macrófagos en una sola cubreobjetos, cuente el cuarto de repuesto.
- Calcule las tasas de infección como amastigotes/macrófagos o amastigotes/100 macrófagos y determine el porcentaje de macrófagos infectados a partir de los datos de cuantificación sin procesar.
