$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Paso de cultivos organoides
- Agregue 1 ml de medio basal frío a la matriz del basamento en el pocillo. Con una micropipeta de 1 ml, pipetear vigorosamente hacia arriba y hacia abajo hasta que se rompa la matriz basal. Transfiera a un tubo de 15 ml. Colocar sobre hielo.
- Tome los organoides en la pipeta y pipetee vigorosamente 10 veces hacia arriba y hacia abajo. La rotura de los organoides se puede observar a simple vista.
>2. Microinyección de cultivo de organoides.
>Nota: Este protocolo se puede utilizar para microinyectar bacterias en organoides. Puede ser útil comenzar la inyección con organoides que sean más permisivos a la microinyección. Por ejemplo, los organoides gástricos de ratón pueden convertirse en organoides quísticos muy grandes que son fáciles de atacar.
- Preparación del material
- Coloque un capilar de vidrio en dos agujas de inyección con un extractor de micropipetas, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. El extractor de micropipetas calentará el capilar de vidrio en el centro y tirará del capilar en dos partes, generando así dos agujas de vidrio. Es práctico sacar varias agujas y guardarlas en una placa de Petri limpia.
- Para permitir la infección bacteriana, retire los antibióticos de todos los medios durante al menos 3 cambios de medio (= una semana). Esto diluirá los antibióticos de la matriz basal. Si usa una cepa bacteriana que es resistente a un antibiótico específico, agregue este antibiótico específico para minimizar las posibilidades de contaminación.
- Prepare el banco de trabajo para las microinyecciones. Para trabajos en diferentes niveles de bioseguridad, puede ser necesario colocar un microscopio estereoscópico dentro de un banco estéril. En este protocolo, inyecte H. pylori en condiciones de nivel de bioseguridad 2 bajo un microscopio estereoscópico dentro de un banco estéril.
- Cultive las bacterias de acuerdo con los protocolos estándar.
- Para estimar la multiplicidad de infecciones (MOI), estime dos parámetros: el número de bacterias y el número de células por organoide, como se describe a continuación. El MOI puede correlacionarse con los resultados, por ejemplo, con la expresión de ARNm de IL-8 del huésped.
- Para calcular la densidad bacteriana en la solución de infección, primero establezca la curva estándar de densidad óptica y unidades formadoras de colonias (UFC) de acuerdo con los protocolos estándar. Una densidad óptica de 0,1 a 550 nm debería producir aproximadamente 107 UFC/ml.
- Para estimar el número de células por organoide, cuente el número de organoides en 1 pocillo. Interrumpa los organoides como se describe en los pasos 1.1-1.4. Después de la centrifugación durante 5 min a 200 x g y 4 °C, añadir 1 ml de solución de disociación enzimática y volver a suspender.
- Incubar a 37 °C con agitación repetida durante 5-10 min. Determine si las células se han disociado en células individuales bajo el microscopio (microscopio invertido como Leica DMIL con un aumento de 10X). Si es necesario, prolongue la incubación.
- Cuente las células por organoide con un hemocitómetro y calcule el número de células por organoide. Los organoides gástricos humanos con un diámetro de aproximadamente 200 μm tienen aproximadamente 4.000 células. La inyección de 0,2 μl de una solución bacteriana con 1 x 109 bacterias por ml da como resultado un MOI aproximado de 50.
- Inyección de organoides.
Nota: Para la microinyección, la aguja de vidrio está estabilizada en un soporte, que se puede maniobrar en 3 dimensiones mediante un micromanipulador. Los organoides permanecen dentro de la matriz del basamento dentro del pozo. Debido al tamaño y la posición en el pocillo, no todos los organoides son igualmente susceptibles de inyección. Por lo general, los 30 organoides más grandes en un pocillo se pueden seleccionar en 5 minutos.
- Recolectar las bacterias y lavarlas en el medio basal de acuerdo con los protocolos estándar.
- Calcule el número de bacterias por ml de acuerdo con la densidad óptica (consulte el paso 2.1.5.1). Diluir las bacterias a 1 x 109 bacterias por ml en un medio basal.
- Toma una aguja de vidrio. Con pinzas, rompa la punta de modo que la abertura tenga aproximadamente 10 μm de ancho.
- Inserte la aguja en el soporte de inyección y fíjela al micromanipulador.
- Introduzca aproximadamente 10 μl de solución bacteriana en la aguja.
- Coloque una placa de 4 pocillos con bordes bajos que contenga cultivos de organoides bajo el microscopio estereoscópico.
- Navegando con el micromanipulador, apunte a un solo organoide con la aguja. Coloque la aguja cerca del organoide y luego inserte la aguja en el organoide con un movimiento rápido. Inyecte aproximadamente 0,2 μl de solución bacteriana en cada organoide utilizando el microinyector.
>3. Cosecha organoides para cualquier análisis.
- Por ejemplo, fije los organoides después de 4 horas. Retire el sobrenadante y agregue 1 ml de formaldehído al 2% e incube 20 min a RT o O/N a 4 °C. Los organoides se pueden procesar para inmunohistoquímica de acuerdo con los procedimientos estándar.