1. Generación de una biblioteca de mutantes de transposones Coxiella marcados con proteína de fluorescencia verde, GFP
Manipule Coxiella burnetii RSA439 NMII en un nivel de contención de bioseguridad 2 (BSL-2) en una cabina de seguridad microbiana (MSC) de acuerdo con las normas locales. Si es compatible con el modelo bacteriano utilizado, repita los pasos de 1.4.1 a 1.4.4 para aumentar la probabilidad de obtener mutantes clonales. Una biblioteca de mutantes típica está compuesta (al menos) por un número de mutantes que es igual a tres veces el número de secuencias codificantes anotadas en el genoma del organismo utilizado.
- Preparación de Coxiella RSA439 NMII electrocompetente:
- Prepare 1x medio de citrato de cisteína acidificado-2 (ACCM-2): 13,4 mM de ácido cítrico, 16,1 mM de citrato de sodio, 3,67 mM de fosfato de potasio, 1 mM de cloruro de magnesio, 0,02 mM de cloruro de calcio, 0,01 mM de sulfato de hierro, 125,4 mM de cloruro de sodio, 1,5 mM de L-cisteína, 0,1 g/L de Bacto Neopeptona, 2,5 g/L de ácidos casamino, 1 g/L de metil beta ciclodextrina, 125 ml/L del Roswell Park Memorial Institute (RPMI). Ajuste el pH a 4.75 y filtre la esterilización (no lo haga en autoclave).
nota: El ACCM-2 líquido es estable a 4 °C durante aproximadamente 1 mes.
- Inocular 100 ml de ACCM-2 con 2 x 106 equivalentes de genoma (GE)/ml de Coxiella RSA439 NMII (a partir de un stock bacteriano previamente generado y cuantificado como en el paso 1.5) a partir de stocks de -80 °C y distribuir la suspensión bacteriana enmatraces de 75 cm 2 cultivos celulares con tapones ventilados (10 - 15 ml de suspensión bacteriana por matraz). Crecer durante 7 días a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% de dióxido de carbono (CO2) y 2,5% de oxígeno (O2).
- Agrupar la suspensión bacteriana resultante en tubos de 50 ml y centrifugar a 3.900 x g durante 1 hora a 4 °C.
- Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 30 ml de glicerol al 10%. Centrifugar a 3.900 x g durante 1 hora a 4 °C.
- Vuelva a suspender el pellet en un volumen adecuado de glicerol al 10% (normalmente 2 ml) y alícuota 50 μl en tubos de 500 μl. Mantenga las bacterias resuspendidas en hielo durante todo el proceso.
nota: En esta etapa, las bacterias son electrocompetentes y una alícuota es suficiente para realizar una electroporación. Las suspensiones bacterianas pueden almacenarse a -80 °C durante 6 meses o utilizarse directamente para la electroporación del ácido desoxirribonucleico (ADN) plásmido.
- Electroporación de Coxiella competente con plásmidos que codifican para transposones y transposasas:
- Preenfriar una cubeta de electroporación de 0,1 cm durante 10 min en hielo. Mezclar 50 μl de Coxiella electrocompetente con 10 μg de plásmido transposón y 10 μg de plásmido transposasa. Asegúrese de que la concentración de plásmidos sea superior a 500 μg/ml para minimizar la dilución del glicerol.
- Electropore utilizando la siguiente configuración: 18 kV, 500 Ω, 25 μF. Asegúrese de que la constante de tiempo resultante esté comprendida entre 9 y 13 mseg.
- Añadir inmediatamente 950 μl de RPMI, resuspender las bacterias electroporadas y transferir a un tubo con tapón de rosca y mantener a temperatura ambiente.
- Tome 200 μl de las bacterias electroporadas y agregue 3 ml de ACCM-2 suplementado con suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor al 1% en placas de 6 pocillos. Añadir 88 μl de dimetilsulfóxido (DMSO) al volumen restante de bacterias electroporadas (para alcanzar una concentración final de 10% de DMSO) y almacenar a -80 °C.
NOTA: para el siguiente protocolo, el elemento transponible y la transposasa están codificados por dos plásmidos diferentes (pITR-CAT-GFP y pUC19-Himar1C9, respectivamente). Ambos plásmidos carecen de un origen de replicación específico de Coxiella, lo que los convierte en plásmidos suicidas cuando se electroporan en Coxiella. Esto garantiza inserciones de transposones estables. El elemento transponible contiene un casete de resistencia a Cloranfenicol bajo la regulación del promotor de Coxiella p1169 para la selección y el gen gfp bajo la regulación del promotor de Coxiella p311 para marcar los mutantes generados con GFP.
- Selección de los mutantes del transposón:
- Incubar las placas de 6 pocillos inoculadas como se ha descrito anteriormente (1.2.4) durante la noche a 37 °C en una atmósfera humidificada de 5% de CO2 y 2,5 % deO2. Añadir los antibióticos adecuados (375 μg/ml de kanamicina o 3 μg/ml de cloranfenicol). Incubar el cultivo bacteriano durante 3 días adicionales en las condiciones descritas anteriormente.
- Aislamiento de mutantes individuales:
- Preparación de placas sólidas ACCM-2 y plateado de mutantes de transposón de Coxiella
nota: Las siguientes instrucciones son para 1 placa de Petri, se deben probar varias diluciones de cultivos bacterianos para evaluar el volumen de inoculación óptimo para el aislamiento de colonias.
- Calentar 10,5 ml de agarosa al 0,5% en el microondas y dejar enfriar al baño maría a 55 °C. Calentar 11,25 ml de 2x ACCM-2 (pH 4,75) a 37 °C.
- Preparar la agarosa de fondo:
- Mezclar 10 ml de agarosa derretida al 0,5% con 10 ml de 2x ACCM-2 y añadir los antibióticos adecuados (375 μg/ml de kanamicina o 3 μg/ml de cloranfenicol).
- Vierta inmediatamente en la placa de Petri. Mantenga la placa de Petri sin tapa, deje que el medio se enfríe durante 30 minutos y seque al aire durante 20 minutos.
- Preparar la agarosa superior:
- Mezclar 1,25 ml de 2x ACCM-2 con 0,75 ml de agua en un tubo de poliestireno de 5 ml, añadir los antibióticos adecuados (375 μg/ml de kanamicina o 3 μg/ml de cloranfenicol) e incubar a 37 °C.
- Agregue el cultivo bacteriano (normalmente de 1 a 100 μl) y el vórtice durante 5 segundos.
- Agregue 0,5 ml de agarosa derretida, mezcle e inmediatamente vierta sobre la agarosa inferior.
- Deje enfriar durante 20 minutos, vuelva a colocar la tapa de la placa de Petri e incube a 4 °C durante 20 minutos para facilitar la solidificación de la agarosa.
- Secar al aire durante 20 minutos sin tapa en un MSC. Placas de cultivo a 37 °C en una atmósfera humidificada de 5% de CO2 y 2,5% deO2 durante 6 a 7 días.
- Añada DMSO a los cultivos bacterianos restantes para alcanzar una concentración final del 10% de DMSO y almacene a -80 °C.
- Evalúe la dilución óptima de la siguiente manera: asegúrese de que las colonias tengan de 0,5 a 1 mm de diámetro y estén debidamente aisladas para evitar la contaminación cruzada. Descongelar los cultivos bacterianos restantes del punto 1.4.2 y colocar la placa en la dilución adecuada en agar ACCM-2, tal como se describe en los puntos 1.4.1.2 y 1.4.1.3. Incubar durante 6 a 7 días como se describe en 1.4.1.3.5.
- Una vez que las colonias sean detectables, recójalas cortando el extremo de una punta de 1 ml, recogiendo el tapón que contiene las colonias aisladas y dispersando la colonia pipeteando 1,5 ml de ACCM-2 que contiene los antibióticos apropiados (375 μg/ml de kanamicina o 3 μg/ml de cloranfenicol) en una placa de 24 pocillos. Amplifique las colonias individuales durante 6 días en las condiciones descritas en 1.3.1. En el día 3 de incubación, disperse los grupos bacterianos pipeteando cada cultivo.
- Almacene cada suspensión mutante en tubos con tapón de rosca con código de barras 2D en placas de 96 pocillos con DMSO al 10% a -80 °C.
- Evaluación de la concentración bacteriana:
nota: Se puede aplicar el siguiente protocolo para obtener las curvas de crecimiento de los mutantes bacterianos que se replican en un medio axénico (ver 1.4.4).
- Preparación de curvas estándar:
- Prepare una solución madre de 2 μg/ml de ADN bicatenario (dsDNA) (normalmente un plásmido aleatorio de tamaño y concentración conocidos) en ácido tris-etilendiaminotetraacético 1x, EDTA (TE). Prepare diluciones en serie 10 veces a partir de la solución madre para obtener concentraciones que oscilan entre 2 μg/ml y 2 ng/ml. Dispensar 50 μl de cada concentración en pocillos individuales de una microplaca de 96 pocillos con paredes y fondo negros (véase la Tabla de Materiales).
- Diluya el reactivo de cuantificación dsDNA 1:200 en 1x tampón TE y añada 55 μl del reactivo diluido a cada muestra en la microplaca de 96 pocillos. Mezclar bien con un agitador de platos e incubar durante 2 a 5 minutos a temperatura ambiente, en la oscuridad.
- Mida la fluorescencia de las muestras utilizando un lector de microplacas de fluorescencia y filtros para longitudes de onda de fluoresceína estándar (excitación ~480 nm, emisión ~520 nm).
- Traza el rango de concentración de plásmidos frente a las lecturas de intensidad de fluorescencia.
- Cuantificación de suspensiones bacterianas:
- Dispensar 5 μl de Triton X-100 al 10% por pocillo en una microplaca de 96 pocillos con paredes y fondo negros (ver Tabla de Materiales). Añadir 50 μl de las suspensiones bacterianas a cada pocillo e incubar durante 10 min a temperatura ambiente, en un agitador de platos.
- Diluya el reactivo de cuantificación dsDNA 1:200 en 1x tampón TE y añada 55 μl del reactivo diluido a cada muestra en la microplaca de 96 pocillos. Mezclar bien con un agitador de platos e incubar durante 2 a 5 minutos a temperatura ambiente, en la oscuridad.
- Mida la fluorescencia de las muestras utilizando un lector de microplacas de fluorescencia y filtros para longitudes de onda de fluoresceína estándar (excitación ~480 nm, emisión ~520 nm).
- Para obtener la concentración de ADN bacteriano, trace las lecturas de fluorescencia en el gráfico obtenido en el punto 1.5.1.4. Divida la concentración de ADN por la masa del genoma de Coxiella (2.2 fg) para obtener las concentraciones bacterianas. Expresa los resultados en Genoma Equivalente/ml.
- Descarte los mutantes que exhiban un defecto de crecimiento significativo en ACCM-2.
>2. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de una sola colonia de cebadores, secuenciación y anotación
NOTA: El siguiente protocolo es para la amplificación de ADN de 96 muestras, se recomienda una pipeta multicanal para los siguientes pasos. La purificación en columna de productos de PCR mediante perlas magnéticas y la secuenciación de ADN con un cebador específico para transposones (2.3) se subcontrata a una empresa externa.
- Asegurar que el cebador de amplificación esté diseñado para hibridar entre 100 y 200 pares de bases aguas arriba de la repetición en tándem invertido (ITR), para obtener productos de PCR que cubran el sitio de inserción del transposón en el genoma de Coxiella. Prepare 3 ml de mezcla de PCR (1x tampón de alta fidelidad, 200 μM de trifosfato desoxinucleósido (dNTPs), 1 μM de cebador de amplificación, 20 U/ml de ADN polimerasa de alta fidelidad) y dispense 29 μl por pocillo en una placa de PCR de 96 pocillos colocada en hielo. Transfiera 1 μl de cada mutante en la fase estacionaria en ACCM-2 a la mezcla de PCR.
- Realice PCR con desnaturalización inicial (98 °C, 1 min), 20 ciclos de alta rigurosidad (98 °C, 10 seg; 50 °C, 30 seg; 72 °C, 90 seg), 30 ciclos de baja rigurosidad (98 °C, 10 seg; 30 °C, 30 seg; 72 °C, 90 seg) y 30 ciclos de alta rigüedad (98 °C, 10 segundos; 50 °C, 30 seg; 72 °C, 90 seg) seguido de una extensión final a 72 °C durante 7 min.
- Purifique los productos de PCR utilizando perlas magnéticas y secuencie el ADN con un cebador específico para transposones. Diseñe el cebador específico del transposón con una temperatura de fusión prevista comprendida entre 50 °C y 75 °C, un contenido de GC entre el 40 % y el 60 %, una longitud entre 18 y 25 nucleótidos, y un sitio de recocido aguas abajo del sitio de hibridación del cebador de amplificación y al menos 100 pares de bases aguas arriba del primer par de bases del transposón ITR.
- Utilizando un software de análisis de secuencias, cargue el genoma completo y anotado de Coxiella burnetii 493 NMI. Utilice la función "alinear con referencia" para cargar y alinear (blastn) los resultados de la secuenciación y determinar el lugar de transposición. Descarte los mutantes que no coincidan y/o muestren lecturas dobles. Para monitorear la saturación de la biblioteca mutante, mantenga un registro de la ocurrencia de múltiples inserciones de transposones en el mismo sitio.
>3. Desafío de las células eucariotas con mutantes de Coxiella y seguimiento del crecimiento intracelular
NOTA: Se recomienda una pipeta multicanal para los siguientes pasos. Las infecciones se realizaron por triplicado en microplacas estériles de 96 pocillos con paredes negras y fondos planos transparentes. El Dr. Robert Heinzen proporcionó la expresión de GFP con Coxiella burnetii.
- Cultive células Vero en RPMI sin rojo de fenol suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS) en ausencia de antibióticos (medios RPMI completos).
- El día antes de la infección, lavar las células Vero de un matraz de cultivo celular confluente o subconfluente con 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Separe las células Vero añadiendo 1 ml de solución de tripsina EDTA al matraz de cultivo celular e incube durante 3 a 5 min a 37 °C en una atmósfera humidificada de 5% de CO2.
- Vuelva a suspender las células en 10 ml de medio RPMI completo. Cuente las células y prepare una suspensión celular de 10a 5 células por ml.
- Dispensar 100 μl de la suspensión de celdas en cada pocillo de una placa negra de 96 pocillos con un fondo plano transparente.
- Centrifugar durante 5 min a 400 x g a temperatura ambiente (RT) para facilitar la adhesión celular en el fondo de los pocillos e incubar durante la noche a 37 °C en una atmósfera humidificada de 5% de CO2.
- Descongele las placas de 96 pocillos que contienen los mutantes de Coxiella en RT y diluya 150 μl de suspensión bacteriana en 300 μl de RPMI sin rojo de fenol y FBS en una placa de 96 pocillos profundos.
- Retire el medio de la microplaca que contiene células Vero y dispense 100 μl/pocillo de mutantes de Coxiella diluidos (MOI de 100). Utilice el pocillo A1 como control negativo (células no infectadas) y los pocillos A2 y A3 como controles positivos (células infectadas con wt Coxiella que expresan GFP en multiplicidades de infecciones (MOI) de 100 y 200).
- Centrifugar la placa durante 10 min a 400 x g en RT utilizando un soporte de placa centrífuga hermético a los aerosoles.
- Incubar a 37 °C en una atmósfera humidificada de 5% de CO2 durante 2 horas y luego reemplazar el medio que contiene bacterias con 100 μl/pocillo de medio RPMI fresco y completo.
- Mida la fluorescencia GFP todos los días durante 7 días utilizando un lector de microplacas de fluorescencia y filtros para longitudes de onda de fluoresceína estándar (excitación ~480 nm, emisión ~520 nm). Para evitar interferencias debidas a la condensación y a la dispersión de la señal en el medio de cultivo, utilice la excitación inferior y el registro de emisiones en el lector de microplacas.
>4. Preparación de muestras para la adquisición automatizada de imágenes
NOTA: El procedimiento es para una placa de 96 pocillos, amplíe los volúmenes en consecuencia. Los escalones de 4.2 pueden aprovechar una arandela de placas.
- A los 7días después de la infección, retire el medio de la placa y reemplácelo con 50 μl/pocillo de medio fresco y completo que contenga un colorante fluorescente permeable a las células en la dilución adecuada (generalmente 1:1,000, que se optimizará de acuerdo con la línea celular utilizada). Incubar las células durante 30 - 60 min a 37 °C en una atmósfera humidificada de 5% de CO2.
- Reemplace el medio con 50 μl/pocillo de paraformaldehído (PFA) al 4% en PBS, incube durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT), luego retire el tampón que contiene PFA y lave 3 veces con PBS.
- Retirar el PBS y dispensar 50 μl/pocillo de solución de bloqueo (0,5% de albúmina sérica bovina, 50 mM de cloruro de amonio, NH4Cl en PBS, pH 7,4) suplementada con 0,05% de saponina. Incubar en RT durante 30 min.
- Sustituya la solución de bloqueo por 40 μl/pocillo de solución de bloqueo fresca suplementada con saponina (como se ha indicado anteriormente) y con un anticuerpo anti-glicoproteína-1 de membrana asociado a lisosoma (anti-LAMP1) en una dilución de 1:500. Incubar la placa durante 30 min en RT.
- Retire la solución de bloqueo y lave la placa de 96 pocillos 5 veces con 100 μl/pocillo de PBS.
- Dispensar 40 μl/pocillo de solución bloqueante suplementada con saponina (como se indicó anteriormente), el anticuerpo secundario apropiado marcado con fluorescencia (a una dilución de 1:1.000) para revelar el anticuerpo anti-LAMP1 aplicado en el paso 4.4, y con Hoechst 33258 a 5 μg/ml. Incubar la placa durante 30 min en RT.
- Retire la solución de bloqueo y lave la placa de 96 pocillos 5 veces con 100 μl/pocillo de PBS. Deje el volumen de PBS correspondiente al último lavado en la placa de 96 pocillos, ya que las celdas fijas no deben secarse.
- Tome una imagen de la placa inmediatamente o guárdela a 4 °C, protegida de la luz, para su posterior análisis.
>5. Adquisición de imágenes
- Adquiera imágenes en los canales GFP (488 nm, bacterias), Hoechst 33258 (350 nm, núcleos de células huésped), rojo (~555 nm, marcador de membrana celular) y rojo lejano (~615 nm, LAMP1) utilizando un microscopio automatizado de epifluorescencia equipado con un objetivo 20X. Adquiera 21 campos independientes por pocillo para obtener imágenes de un mínimo de 5.000 células por muestra. Aplique el enfoque automático utilizando el canal de los núcleos de la célula huésped como referencia. Cuando se trabaja con patógenos bacterianos que infectan un bajo porcentaje de células huésped, los usuarios pueden ajustar el número de campos independientes imageizados por pocillo, con el fin de obtener un mínimo de 500 células infectadas para analizar.
