Los siguientes protocolos describirán métodos para cultivar y estudiar la invasión de la especie anaeróbica, P. gingivalis; sin embargo, estos protocolos pueden usarse para una serie de patógenos anaeróbicos. Aunque se utilizan HUVEC, este protocolo se puede utilizar para otras células eucariotas, tanto inmunitarias como no inmunes.
1. Uso y mantenimiento de la cámara anaeróbica
>Nota: P. gingivalis es un anaerobio sensible a los niveles normales de oxígeno que se encuentran en el aire ambiente. Un ambiente anaeróbico controlado es vital para el cultivo de P. gingivalis.
- Aquí, mantenga una atmósfera artificial designada como gas anaeróbico mezclado (80% N2, 10% H2, 10% CO2) en una cámara anaeróbica de vinilo (Figura 1A). Utilice una esclusa de aire (Figura 1B) para transferir elementos del entorno del laboratorio a la cámara anaeróbica. La esclusa funciona manualmente, purgando dos veces con gas N2 antes de introducir el gas anaeróbico mezclado.
- Utilice una columna de eliminación de sulfuro de hidrógeno (Figura 1C) para eliminar sin mantenimiento el sulfuro de hidrógeno indeseable. Coloque un deshumidificador dentro de la cámara para eliminar el H2O creado por el catalizador y para evitar aerosoles que faciliten la propagación de la contaminación.
nota: El sulfuro de hidrógeno es un subproducto metabólico natural de muchas bacterias anaeróbicas y su acumulación es tóxica para las bacterias y puede provocar daños en la electrónica y disminuir la vida útil de un catalizador.
- Utilice una caja de ventilador para hacer circular la atmósfera de la cámara a través de un catalizador de paladio, que elimina el oxígeno en presencia de hidrógeno (Figura 1D).
Nota: Un filtro atmosférico de recirculación (aire de partículas de alta eficiencia o HEPA) elimina los contaminantes transportados por el aire con un tamaño de 0,22 μm o más.
- Cultivo de bacterias anaeróbicas en una incubadora a 37 °C que se encuentra dentro de la cámara anaeróbica. Utilice técnicas asépticas estándar cuando trabaje dentro de la cámara anaeróbica.
>2. Preparación de bacterias anaeróbicas
>Nota: P. gingivalis es aerotolerante y puede almacenarse en condiciones aeróbicas, pero no crecerá en presencia de oxígeno a niveles superiores al 6%. Una cámara anaeróbica es necesaria para el cultivo adecuado de P. gingivalis y otras especies anaeróbicas (Figura 1). Se requiere una capacitación y educación adecuadas sobre el uso de la cámara anaeróbica antes de trabajar con microanaerobios.
- Equilibre todos los medios líquidos y las placas a condiciones anaeróbicas durante al menos 12 horas antes de la experimentación para eliminar el oxígeno residual.
- Transfiera P. gingivalis de un congelador a -80 °C a una cámara anaeróbica y deje descongelar.
- Raya de P. gingivalis en placas de agar sangre de soja tripticasa (TSA II con 5% de sangre de oveja). Envuelva las placas en parafilm y guárdelas a 37 °C en una incubadora anaeróbica durante 4-7 días.
- Inocular P. gingivalis en 3 ml de caldo de infusión cerebro-corazón (BHI) suplementado con hemina y menadiona, un medio líquido no selectivo enriquecido para el aislamiento y cultivo de microorganismos anaeróbicos y exigentes, utilizando asas estériles.
nota: Para el almacenamiento a largo plazo, mezcle los cultivos bacterianos preparados en BHI con glicerol o DMSO (10-20% de concentración final) y colóquelos en un congelador a -80 °C.
- Prepare un cultivo iniciador de P. gingivalis haciendo una dilución 1:10 y permitiendo que las bacterias crezcan hasta la fase mitad del registro.
>Nota: Se determina la densidad óptica de la suspensión bacteriana y se ajusta la concentración bacteriana para cada cepa a examinar. Para P. gingivalis, una suspensión a DO660 de 0,7 corresponde a la fase media del logaritmo y ~7 x 108 células/ml. Las condiciones de crecimiento descritas en el protocolo anterior son específicas para P. gingivalis y es posible que deban adaptarse para otras cepas bacterianas.
3. Cultivo de células endoteliales
>Nota: Compre HUVIC primarios agrupados y cultivo en medio basal que contenga factores de crecimiento endotelial vascular (VEGF) a 37 °C en 5% de CO2 de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Semillas HUVECs en matraces T-75 de 2,5 x 105 células/matraz en medios VEGF de 15 ml.
nota: Comprobar la viabilidad mediante una dilución 1:1 con un 4,0% de azul de tripano. Las células con una membrana comprometida retendrán el azul tripán, y las células sanas con membranas intactas aparecerán blancas cuando se observan bajo un microscopio óptico binocular. Cuente 100 células y asegúrese de que más del 80% de las células sean viables.
- Reemplace los medios cada 2 días con medios VEGF frescos precalentados hasta que las celdas alcancen ~80% de confluencia.
- Lave las células una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS) precalentada. Libere las células del matraz T75 incubando con 2 ml de tripsina-EDTA (0,25%) durante 5 minutos seguido de 2 ml de solución neutralizante de tripsina.
- Recoja los HUVEC suspendidos en un tubo cónico de 50 ml. Lave las células adicionales de los matraces T-75 con PBS y transfiéralas a tubos cónicos de 50 ml.
- Centrifugar las celdas a 200 x g durante 10 min.
- Retire el sobrenadante y suspenda el pellet celular en 10 ml de medio VEGF precalentado.
- Determine la concentración de células utilizando un hemocitómetro o un dispositivo de recuento de células similar.
- Calcule la cantidad de suspensión celular que se debe agregar a una placa de 6 pocillos (400.000/pocillo) o a una placa de 12 pocillos con cubreobjetos (50.000/pocillo). Los HUVEC estarán listos para la experimentación al día siguiente.
>4. Ensayo de supervivencia Invasión/Interacción (Placa)
>Nota: Al realizar este ensayo, prepare dos placas de 6 pocillos de células endoteliales sembradas a 400.000 células/pocillo. Se utilizará una placa para evaluar las bacterias adheridas e internalizadas por las células huésped. La otra placa dará cuenta de las bacterias intracelulares. La placa de 6 pocillos permite triplicar dos muestras en un solo experimento. Para obtener un resumen de este protocolo, consulte el diagrama de flujo del ensayo de supervivencia (Figura 2).
- Prepare las bacterias anaerobias como se ha descrito anteriormente (ver sección 1) hasta que alcancen la mitad del crecimiento logarítmico (DO660 0,5-0,7).
- Centrifugar las bacterias a 5.000 x g durante 10 min.
Nota: Si la centrífuga está fuera de una cámara anaeróbica, lleve las muestras bacterianas en un tubo de 15 ml herméticamente sellado y envuelva la tapa con parafilm para evitar fugas de oxígeno.
- Vuelva a colocar P. gingivalis granulado en la cámara y deseche el sobrenadante. Lavar con PBS y pellets de bacterias nuevamente antes de volver a suspender en medios VEGF. Prepare suspensiones para todas las cepas bacterianas que se van a analizar a DO660 de 0,7, que corresponde a la fase de registro medio (~7 x 10,8 células/ml). Las bacterias ahora están listas para la infección.
- Transfiera las placas de 6 pocillos que contienen HUVEC de la incubadora de cultivo de tejidos a la cámara anaeróbica. Retire los medios y lave tres veces con PBS anaeróbico. Añada 2 ml de medio anaeróbico VEGF a cada pocillo y coloque las placas a 37 °C en la incubadora anaeróbica durante 20 min para equilibrar la temperatura de infección><.
nota: Coloque las bacterias en placas de agar sangre para garantizar que las que se utilizan para la infección sean homogéneas y no se contaminen después de la infección.
- Infectar células huésped con bacterias a una multiplicidad de infección (MOI bacteria: huésped) de 100:1.
nota: El número de células HUVEC se determina mediante la realización de una prueba de exclusión de tripano en un solo pocillo antes de la infección. El número de células bacterianas se determina mediante la densidad óptica (por ejemplo, OD de 0,5 = 5 x 108 células/ml). La concentración bacteriana se ajusta al MOI adecuado en función de la concentración de HUVEC.
- Coloque placas de 6 pocillos con HUVC infectados en la incubadora anaeróbica y permita que las bacterias interactúen con las células huésped durante 30 minutos.
- Prepare la saponina en BHI (1,0% p/v) dentro de la cámara anaeróbica y filtre a través de un filtro de 0,2 μm.
- Supervivencia de las bacterias adheridas e internalizadas.
- Retire las placas de la incubadora, aspire los medios, lave tres veces con PBS anaeróbico y agregue 2 ml de saponina filtrada al 1,0% (preparada como se describe en el paso 4.8). Incubar durante 15 minutos para permitir la lisis de la célula huésped.
- Raspe el fondo de cada pocillo con un raspador de celdas. Recoja la mezcla de células de cada pocillo y haga una dilución 1:1 en BHI.
- Proceda a realizar diluciones en serie de la muestra. Dependiendo de la especie bacteriana y la concentración, ajuste las diluciones en serie. Comience con diluciones 1:100 o 1:1,000.
- Placa de 200 μl de la dilución deseada en placas de agar sangre. Envuelva las placas en parafilm y colóquelas en la incubadora anaeróbica a 37 °C.
- Después de siete días de incubación a 37 °C, retire las placas y cuente las unidades formadoras de colonias (UFC) utilizando una caja de luz para contar las colonias manualmente.
nota: Se enumeran las UFC. Para cantidades mayores de UFC, se pueden tomar imágenes y se puede utilizar software de computadora para facilitar la enumeración de las UFC.
