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1. Internalización de bacterias en células huésped (microscopía fluorescente)
>Nota: P. gingivalis está marcado con 2',7'-Bis-(2-Carboxietil)-5-(y-6)-Carboxifluoresceína, Éster de Acetoximetílico (BCECF-AM). BCECF-AM es un colorante permeable a la membrana no fluorescente; su conversión en fluoresceína BCECF a través de la acción de esterasas intracelulares puede indicar la viabilidad celular. P. gingivalis se marca con el colorante BCECF-AM y luego se usa para infectar células eucariotas. Después de la infección, las células se fijan y se marcan con DAPI y TRITC-faloidina. La tinción DAPI utilizada para teñir el núcleo de la célula eucariota también marcará el núcleo de la célula bacteriana, lo que proporciona una contramedida para identificar bacterias no viables que no pueden escindir metabólicamente BCECF-AM. Las células huésped se resaltan con TRITC-faloidina, un colorante rojo de actina.
- Cubreobjetos de autoclave. Agregue asépticamente cubreobjetos a placas de 12 pocillos antes de sembrar las células endoteliales en 5 x 104 células/pocillo. (Preparado el día antes del experimento)
- Tener células endoteliales preparadas en cubreobjetos circulares de 18 mm (#1.5 de espesor) en placas de 12 pocillos como se describió anteriormente.
- Preparar bacterias anaerobias cultivadas hasta la fase logarítmica media (OD660 = 0,5-0,7).
- Lave las bacterias 2 veces con PBS anaeróbico centrifugando a 5.000 x g y suspendiendo el pellet en PBS a 5-7 x 108 células/ml.
- Añadir 20 μl de 0,2 mM DE BCECF-AM a 2 ml de suspensión bacteriana (5-7 x 108 células/ml) hasta una concentración final de BCECF-AM de 2 μM.
- Incubar a 37 °C durante 30 min en la oscuridad.
- Transfiera placas con células endoteliales sembradas en cubreobjetos circulares de 18 mm (#1,5 de grosor) desde la incubadora de cultivo de tejidos a la cámara anaeróbica. Lavar con PBS e intercambiar con medios anaeróbicos de VEGF.
Nota: Verifique que los HUVEC estén sanos bajo un microscopio óptico. HUVECS debe ser ~ 80% confluente, la morfología debe ser comparable a la de los fabricantes.
- Centrifugar las bacterias marcadas a 5.000 x g durante 10 minutos para eliminar el colorante BCECF-AM residual. Suspender en 2 ml de medio anaeróbico VEGF.
- Infecte las células huésped con bacterias marcadas en un MOI de 100:1 (bacteria: huésped).
- Incubar en una cámara anaeróbica a 37 °C durante 30 min.
- Después de la infección, lavar las células con PBS tres veces y fijarlas en paraformaldehído al 4,0% recién preparado durante 10 min.
nota: Después de fijar las células, los experimentos se pueden realizar fuera de la cámara anaeróbica.
- Lave los cubreobjetos con PBS tres veces.
- Añadir 1 ml de Triton X-100 al 0,2% durante 10 min.
- Lave los cubreobjetos con PBS tres veces.
- Añadir 50 μl de faloidina TRITC (50 μg/ml) a los cubreobjetos durante 45 min.
- Lave los cubreobjetos tres veces, retírelos de la placa de 12 pocillos y colóquelos en un portaobjetos con un medio de montaje suave que contenga DAPI. Selle los lados con esmalte de uñas.
nota: Las diapositivas pueden almacenarse durante un par de meses en la oscuridad. Evite la exposición a la luz para evitar el fotoblanqueo.
- Vea los portaobjetos con un microscopio confocal.
- En este caso, utilice un sistema espectral de 34 canales (detector de matriz de 32 canales y dos detectores PMT laterales, además de un detector de luz transmitida) configurado alrededor de un soporte AxioObserver (invertido) con una etapa XY motorizada. El sistema cuenta con cinco láseres: diodo azul (405 nm), argón multilínea (458, 488, 514 nm), diodo verde (561 nm), HeNe rojo (633 nm) y un láser pulsado de 440 nm. Equipe un sistema de imágenes de fluorescencia de por vida con 2 detectores híbridos de GaAsP (para FRET-FLIM).
- Detecte la fluorescencia de DAPI y TRITC en un canal utilizando un filtro de doble banda con longitudes de onda de excitación de 340-380 nm y 540-560 nm, y un filtro de emisión de 435-485 nm y 570-590 nm respectivamente. Detecte la fluorescencia de BCECF-AM utilizando un filtro con una longitud de onda de excitación de 440-500 nm y un filtro de emisión de 510-590 nm.
nota: Se deben realizar controles para BCECF-AM en cada cepa bacteriana que se esté estudiando para garantizar el etiquetado adecuado de las bacterias viables. En primer lugar, validar que las bacterias no viables son DAPI positivas y BCECF negativas. En segundo lugar, asegúrese de que las bacterias vivas puedan metabolizar BCECF-AM en fluoresceína BCECF. Es posible que sea necesario analizar las concentraciones variables de la bacteria o del colorante BCECF-AM para obtener un etiquetado óptimo.