>1. Cultivo, diferenciación y validación de células HL-60
- Prepare el medio de cultivo celular HL-60 compuesto por 500 mL de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) con L-glutamina y 50 mL de suero fetal bovino inactivado por calor. No agregue antibióticos, ya que esto puede afectar la diferenciación de las células HL-60.
- Para la propagación/mantenimiento de las células HL-60, cultive 5 x 106 células en 10 mL de medios de cultivo celular HL-60 enmatraces de 75 cm2 ventilados a 37 °C y 5% de dióxido de carbono (CO2). Pase las células cada 3-4 días para mantener las concentraciones celulares óptimas.
nota: La concentración celular no debe exceder de 5 x 106/mL.
- Genere existencias de trabajo de células HL-60 alícuotas de aproximadamente 1 x 106 células/mL en medios de cultivo HL60 con 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) en tubos criogénicos de 1 mL.
nota: Las existencias de trabajo pueden almacenarse a -80 °C. El material maestro debe almacenarse a -120 °C.
- Diferencie las células HL-60 cultivando 1,5 x 107 células en 15 mL de medio de cultivo celular HL-60 con 0,6% de N, N-dimetilformamida (DMF) a 37 °C y 5% de CO2 en matraces estériles de 75 cm2 con tapa de filtro durante 3 días antes de la actividad de eliminación opsonofagocítica (OPKA).
- Validar que las células HL-60 se han diferenciado con éxito y son apropiadas para su uso en el ensayo OPKA mediante la prueba de la viabilidad y los marcadores de superficie celular de acuerdo con los protocolos de citometría de flujo establecidos. Después de la diferenciación, recoja las células HL-60 y tiña aproximadamente 1 x 104 células con anticuerpos/tinciones conjugados con fluorescencia para CD71, CD35, anexina V y yoduro de propidio><.
nota: Las células diferenciadas deben ser ≥65% viables, ≥55% CD35+ y ≤20% CD71+ según lo determinado a través de los protocolos de validación establecidos (Figura 1).
>2. Preparación de tampones y reactivos OPKA
- Prepare 50 mL de tampón de opsonización estéril B (OBB) mezclando 42,5 mL de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) 1x con Ca2+/Mg2+, 5 mL de suero fetal bovino inactivado por calor y 2,5 mL de gelatina estéril al 0,1%. Conservar a 4 °C.
- Obtener complemento de conejo bebé y almacenar a -80 °C.
- Obtener o preparar placas de cultivo bacteriano (es decir, placas de agar sangre de ovejade 15 x 100 mm 2 5%).
>3. Preparación de muestras de stock bacteriano
- Obtener un caldo de la(s) cepa(s) bacteriana(s) a analizar.
NOTA: Para este protocolo, se utiliza el serotipo 3 Streptococcus pneumoniae (WU2, generosamente proporcionado por el Dr. Moon Nahm).
- Cultive la cepa bacteriana en un caldo apropiado (es decir, caldo Todd-Hewitt + 0,5% de extracto de levadura para esta cepa WU2) durante aproximadamente 2-4 h a 37 °C.
nota: La densidad óptica a 600 nm (OD600) del cultivo debe estar entre 0,6 y 0,8.
- Granular las bacterias por centrifugación a 6.000 x g durante 2 min y resuspender las células en 10-30 mL de glicerol al 15% en el caldo adecuado. Alicuota el cultivo bacteriano (500 μL por alícuota) en tubos de centrífuga estériles de 1,5 mL y almacenar a -80 °C.
- Descongele un vial de caldo bacteriano en un baño de agua a 37 °C. Granular las células bacterianas y resuspender en 500 μL de OBB en condiciones estériles.
- Prepare diferentes diluciones del stock bacteriano en OBB (es decir, 10 μL de no dilución, 10 μL de 1:10, 10 μL de 1:100, etc.). Realice el ensayo OPKA (secciones 4 a 6, incluido el cocultivo HL-60/complemento) como se describe a continuación utilizando varias diluciones del stock bacteriano no tratado. Cultive las placas durante la noche a 30 °C (sin CO2).
nota: La temperatura de 30 °C es específica para WU2 para evitar el crecimiento excesivo; otras cepas/serotipos pueden crecer de manera óptima a 37 °C.
- Cuente las colonias para cada dilución de stock bacteriano no tratado co-cultivado con células HL-60 y complemento. Determine qué dilución de bacterias produce el número óptimo de colonias contables (aproximadamente 80-120 unidades formadoras de colonias (UFC) para bacterias no tratadas cocultivadas con células HL-60). Tenga en cuenta esta dilución para futuros OPKA que involucren este stock bacteriano.
>4. Tratamiento y cultivo bacteriano
- Descongele un tubo de material bacteriano preparado en el paso 3.3. Granular bacterias (6.000 x g durante 2 min) y resuspender el pellet celular en OBB a la dilución óptima según lo determinado en el paso 3.6.
- Pipetear 10 μL de dilución bacteriana resuspendida por pocillo en una placa de cultivo celular de 96 pocillos de fondo redondo.
- Añada 20 μL de anticuerpo o tratamiento farmacológico adecuado a cada pocillo experimental por duplicado.
NOTA: En este protocolo, se agrega un anticuerpo específico del serotipo generado en ratones como tratamiento X, y una enzima glucósido hidrolasa conocida por degradar la cápsula de polisacárido del serotipo 3 se agrega como tratamiento Y (Figura 2). Para los pozos de control, use 1x PBS u OBB, dependiendo del tampón utilizado para los pozos de tratamiento.
- Agite la placa de muestra a aproximadamente 90 rpm durante 1 h a temperatura ambiente. Ajuste estas condiciones en función de la temperatura óptima o de las condiciones de agitación de los tratamientos que se estén probando.
5. Cocultivo bacteriano HL-60
- Prepare las células HL-60 recolectando las células diferenciadas HL-60 tratadas con DMF tres días antes (consulte el paso 1.4) en tubos cónicos de 15 ml. Granular las células (500 x g, 3 min), desechar el sobrenadante y lavar con al menos 10 mL de 1x PBS.
- Granule las células lavadas (500 x g, 3 min), deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en OBB (comience con 1 mL de OBB y ajuste para una concentración final de 1 x 107/mL después del recuento de células).
- Añadir complemento de conejo bebé (suero de conejo bebé estéril y sin diluir, de 3 a 4 semanas de edad) a un volumen final de 1:5.
nota: La concentración final de la mezcla de complemento HL-60 debe ser de 1 x 107/mL. Si se prueba la dependencia del complemento, se puede utilizar una segunda solución que contenga células HL-60 activas con complemento inactivado por calor (el complemento puede inactivarse incubando en un baño de agua a >55 °C durante al menos 30 min).
- Después de completar 1 h de cultivo bacteriano (paso 4.4), divida cada muestra (es decir, 10 μL de cada pocillo de muestra de 30 μL en dos pocillos nuevos) en pocillos duplicados para dos grupos (es decir, use solo 20 μL del cocultivo original de 30 μL para tener en cuenta el error de pipeteo): un conjunto se cocultivará con el complemento HL-60 y el otro incluirá solo bacterias. Añadir 50 μL de la mezcla de complemento HL-60 (del paso 5.3) a cada conjunto experimental de pocillos (delegado +HL-60); añadir 50 μL de OBB solo a los pocillos de bacterias (delegado -HL-60).
nota: Para este ejemplo, se utilizan aproximadamente 800 UFC bacterianas para el cocultivo inicial con 5 x 105/50 μL de células HL-60. Si esta multiplicidad de infecciones es demasiado alta o demasiado baja, según lo indicado por el número final de colonias, ajuste la dilución bacteriana inicial en lugar del recuento de células HL-60.
- Agite la placa de 96 pocillos a 37 °C durante 1 h (sin CO2).
>6. Siembra de muestras e incubación nocturna
- Diluir cada pocillo 1:5 con OBB, de modo que cada muestra tenga un volumen de al menos 50 μL.
- Pipetear 50 μL de cada muestra directamente en un área designada de una placa de cultivo bacteriano, asegurando un espacio adecuado entre las muestras. Para2 placas de agar redondas de 15 x 100 mm, pipete aproximadamente 4 muestras en una placa.
- Cubra y deje que las muestras se sequen durante aproximadamente 15 minutos a temperatura ambiente.
- Invertir las placas y el cultivo durante la noche a 30 °C (sin CO2). Alternativamente, placas de cultivo en frascos anaeróbicos para probar si las condiciones anóxicas afectan el crecimiento bacteriano o para controlar la morfología.
- Después del cultivo durante la noche, cuente las colonias en cada área de muestra designada. Analice los datos comparando el número de células vivas en cada conjunto con el control correspondiente y/o las muestras que no reciben el cocultivo de células HL-60 (indicativo de 100% de supervivencia celular, 0% de muerte celular).
