Evaluación de Porphyromonas gingivalis internalizado en células endoteliales del huésped

Resumen

Fuente: Wunsch, C. M., et al. >Porphyromonas gingivalis como organismo modelo para evaluar la interacción de bacterias anaerobias con células huésped. J. Vis. Exp. (2015)

En este video, demostramos un ensayo para evaluar la supervivencia de Porphyromonas gingivalis dentro de células endoteliales humanas. La medida de supervivencia y crecimiento de Porphyromonas gingivalis internalizada se evalúa por el número de colonias en la placa de agar sangre.

Protocolo

1. Supervivencia de las bacterias internalizadas.

1. Prepare las bacterias anaerobias de P. gingivalis hasta que alcancen la mitad del crecimiento logarítmico (OD₆₆₀ 0,5-0,7).
2. Centrifugar las bacterias a 5.000 x g durante 10 min.
3. Vuelva a colocar P. gingivalis granulado en la cámara y deseche el sobrenadante. Lavar con PBS y pellets de bacterias nuevamente antes de volver a suspender en medios VEGF. Prepare suspensiones para todas las cepas bacterianas que se van a analizar a DO₆₆₀ de 0,7, que corresponde a la fase de registro medio (~7 x 10,⁸ células/ml). Las bacterias ahora están listas para la infección.
4. Transfiera las placas de 6 pocillos que contienen HUVEC de la incubadora de cultivo de tejidos a la cámara anaeróbica. Retire los medios y lave tres veces con PBS anaeróbico. Añada 2 ml de medio anaeróbico VEGF a cada pocillo y coloque las placas a 37 °C en la incubadora anaeróbica durante 20 minutos para equilibrar la temperatura de infección.
5. Infectar células huésped con bacterias a una multiplicidad de infección (MOI bacteria: huésped) de 100:1.
   nota: El número de células HUVEC se determina mediante la realización de una prueba de exclusión de tripano en un solo pocillo antes de la infección. El número de células bacterianas se determina mediante la densidad óptica (por ejemplo, OD de 0,5 = 5 x 10⁸ células/ml). La concentración bacteriana se ajusta al MOI adecuado en función de la concentración de HUVEC.
6. Coloque placas de 6 pocillos con HUVC infectados en una incubadora anaeróbica y permita que las bacterias interactúen con las células huésped durante 30 minutos.
7. Prepare la saponina en BHI (1,0% p/v) dentro de la cámara anaeróbica y filtre a través de un filtro de 0,2 μm.
8. Retire las placas de la incubadora. Lavar tres veces con PBS anaeróbico y añadir 2 ml de medios de VEGF con antibiótico suplementado (300 μg/ml de gentamicina y 400 μg/ml de metronidazol).
9. Incuba durante 1 hora. Asegúrese de probar los antibióticos para que sean 100% efectivos para matar la cepa bacteriana deseada y asegúrese de que no penetren en las células huésped.
10. Aspirar los medios, añadir 2 ml de saponina filtrada al 1,0%. Incubar durante 15 minutos para permitir la lisis de la célula huésped.
11. Raspe el fondo de cada pocillo con un raspador de celdas. Recoja la mezcla de células de cada pocillo y haga una dilución 1:1 en BHI.
12. Prepare diluciones seriadas de la muestra (1:100, 1:1.000).
13. Placa de 200 μl de la dilución deseada en placas de agar sangre. Envuelva las placas en parafilm y colóquelas en una incubadora anaeróbica.
14. Después de siete días de incubación a 37 °C, retire las placas y cuente las UFC.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cámara anaeróbica de vinilo tipo B	Productos de laboratorio Coy		Incubadora modelo 2000
TSA II Agar Tripticasa de Soja con 5% de Sangre de Oveja	Bbl	221261
Células endoteliales de la vena umbilical humana Grupo de 10 donantes	Tecnología LifeLine	FC-0044
VascuLife VEGF Kit Completo Mediano	Tecnología LifeLine	LL-0003
TrypKit	cuerda salvavidas	LL-0013
saponina	Riedel-de Haen	Año 16109
Sal de sulfato de gentamicina	Sigma-Aldrich	G-1264
metronidazol	Sigma-Aldrich	M-3761