Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Expresión y purificación de anticuerpos
- Mantenimiento de las células del ovario del hámster chino (CHO)
- Cultive células CHO en FreeStyle CHO Media complementado con 1x suplemento de glutamina disponible comercialmente a 37 °C agitando a 130 rpm con 5% de CO2 utilizando matraces Erlenmeyer delong, ya sea de vidrio o desechables.
nota: Se recomienda encarecidamente utilizar un matraz deflector con tapón ventilado para aumentar la agitación y mejorar la transferencia de gas durante las condiciones de agitación. Se ha obtenido una reducción significativa del rendimiento de anticuerpos con matraces regulares (sin deflectores) debido a la agitación limitada del cultivo en suspensión.
- Mantenga el número de células entre 1-5 x 106 células/ml con una viabilidad celular del >95%. Si el número de células aumenta más de 5 x 106 células/mL, divida las células. Nunca permita que las células CHO alcancen menos de 0,2 x 106 células/mL.
- Transfección de células CHO
- Cultive células CHO en 200 mL de medio (2 x 106 células/mL) en matraces deflectores Erlenmeyer largos.
nota: Los cultivos en suspensión cultivados en matraces con deflectores siempre han producido mayores rendimientos de proteínas en comparación con cuando se cultivan en matraces sin deflectores.
- En un tubo de 15 mL, tome 5 mL de medio CHO FreeStyle y agregue 50 μg de ADN del clon VH y 75 μg de ADN del clon VL. Vórtice para mezclar bien.
- Incubar la mezcla de ADN a temperatura ambiente durante 5 min.
nota: Una incubación más larga reduce los rendimientos de proteína.
- Agregue 750 μL de caldo de polietileneimina (PEI) de 1 mg/mL a la solución de ADN y vórtice agresivamente la mezcla durante 30 s. Incube a temperatura ambiente durante 5 min.
adicionales
nota: El PEI debe elaborarse fresco. Múltiples ciclos de congelación y descongelación de PEI reducen significativamente el rendimiento general.
- Agregue toda la mezcla de ADN y PEI a las células mientras agita manualmente el matraz. Incubar inmediatamente los matraces deflectores Erlenmeyer delong con las células a 37 °C agitando a 130 rpm.
- Expresión
nota: El anticuerpo tiene un péptido señal secretor diseñado para su extremo N-terminal, que ayuda a que los anticuerpos se secreten en los medios.
- Cultive las células transfectadas a 37 °C, agitando a 130 rpm el día 1.
- El día 2, agregue 2 mL de agente antiaglomerante 100x y 2 mL de solución antibacteriana-antimicótica 100x. Cambie el matraz a una temperatura más baja (32-34 °C), agitando a 130 rpm.
- Cada quinto día, agregue 10 ml de alimento de triptona N1 y 2 ml de suplemento de glutamina 100x.
- Siga contando las células cada tres días con un hemocitómetro después de teñir una alícuota de células con una tinción de azul de tripano. Asegúrese de que la viabilidad de la célula se mantenga por encima del 80%.
- En el día 10 u 11, coseche el medio para la purificación de anticuerpos. Centrifugar el cultivo a 3000 x g, 4 °C durante 40-60 min y, a continuación, filtrar los medios transparentes con filtros de botella de 0,22 μM.
- Purificación
nota: La purificación de anticuerpos se realiza utilizando una columna de proteína-A disponible en el mercado (ver Tabla de Materiales), utilizando una bomba peristáltica.
- Equilibre la columna con el volumen de dos columnas de tampón de unión (20 mM de fosfato de sodio a pH 7,4).
- Pase el medio filtrado que contiene el anticuerpo (obtenido en el paso 1.3.5) a través de la columna a un caudal de 1 mL/min.
- Lave la columna con el volumen de dos columnas del búfer de encuadernación.
- Eluir el anticuerpo en fracciones de 500 μL utilizando un tampón de elución de 5 mL (acetato de sodio de 30 mM a pH 3,4).
- Neutralizar el pH del anticuerpo eluido añadiendo 10 μL de tampón de neutralización (acetato de sodio 3 M a pH 9) por fracción.
nota: La fracción número 3-6 contiene la mayor parte del anticuerpo. Es aconsejable conservar todas las fracciones en caso de que el anticuerpo se eluya en una fracción posterior a la esperada.
- Mida la concentración de anticuerpos purificados utilizando un espectrofotómetro seleccionando el protocolo predeterminado para la inmunoglobulina G (IgG). La concentración final del anticuerpo se obtiene en mg/mL considerando el peso molecular y el coeficiente de absorción.
>2. Etiquetado fluorescente
NOTA: Los anticuerpos se marcan con el colorante infrarrojo que contiene un grupo reactivo éster del NHS, que se acopla a las proteínas y forma un conjugado estable. Esta reacción es sensible al pH y funciona mejor a pH 8,5. Los conjugados fluorescentes marcados con el colorante muestran un máximo de absorción de 774 nm y un máximo de emisión de 789 nm. El pH 8,5 es clave para una conjugación efectiva.
- Diálisis 0,5 mL del anticuerpo utilizando un casete de diálisis (0,1-0,5 mL) en 1 L de tampón de conjugación (50 mM de tampón de fosfato a pH 8,5). Después de 4 h, transfiera el casete de diálisis a un tampón nuevo y dialice durante la noche.
- Configure una reacción de conjugación añadiendo 0,03 mg de IRDye 800CW por 1 mg de anticuerpo en un volumen de reacción de 500 μL.
nota: IRDye 800CW se disuelve en DMSO a una concentración de 10 mg/mL.
- Realizar reacciones de etiquetado durante 2 h a 20 °C.
nota: Aumentar el tiempo más allá de 2 horas no mejora el etiquetado.
- Purifique los conjugados marcados mediante diálisis extensiva frente a 1x PBS.
- Estime el grado de marcaje midiendo la absorbancia del colorante a 780 nm y la absorbancia de la proteína a 280 nm. La contribución del colorante a la señal de 280 nm es del 3%.
- Calcule la relación colorante/proteína usando esta fórmula:
donde 0,03 es un factor de corrección para la absorbancia del colorante utilizado a 280 nm (igual al 3,0 % de su absorbancia a 780 nm), εDye y εProtein son coeficientes de extinción molar para el colorante y la proteína (anticuerpo) respectivamente.
NOTA: εEl colorante es de 270.000 M-1 cm-1 y la εProteína es de 203.000 M-1 cm-1 (para una IgG típica) en una mezcla 1:1 de PBS: metanol. Las proteínas distintas de la IgG pueden tener coeficientes de extinción molar muy diferentes. El uso del coeficiente de extinción correcto para la proteína de interés es esencial para la determinación precisa de la relación D/P.
- Calcule la concentración final de proteína usando esta fórmula:
nota: Confirme siempre la eficacia de unión al antígeno de los anticuerpos marcados y no marcados mediante ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas) o citometría de flujo antes de proceder a los estudios in vivo.
3. Estudios de xenoinjertos de ratón
- Preparación de las células tumorales para la inyección
- Cultive células OVCAR-3 en el medio RPMI-1640, suplementado con un 10% de FBS y 1x penicilina-estreptomicina.
- El día antes de la inyección, subcultive las células en nuevas placas de cultivo de 100 mm con 10 mL de medio/placa completo. Utilice un número de celda de 0,5-1 x 106 células/plato.
- Incubar los cultivos a 37 °C de temperatura, 95% de humedad y 5% de CO2 durante 20-24 h.
- El día de la inyección, retire el medio de crecimiento de las placas de cultivo. Enjuague bien la capa celular con solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco sin Ca2+/Mg2+ para eliminar las células muertas, los desechos celulares y todos los rastros de suero, que puedan interferir con la acción de la tripsina.
- Tripsinizar las células añadiendo 1,0-1,5 mL de solución de tripsina-EDTA a cada placa e intentar esparcir la solución inclinando la placa por completo, seguida de una incubación a 37 °C durante 5-10 min.
nota: Observe las células bajo un microscopio invertido para verificar el estado real de tripsinización. La tripsinización insuficiente da como resultado un menor número de células que se desprenden de la superficie de la placa de cultivo, la tripsinización excesiva induce estrés celular. Por lo tanto, es importante una tripsinización adecuada.
- Agregue 1.0-1.5 mL de medio de crecimiento completo a cada placa para detener la acción de la tripsina, luego de eso, vuelva a suspender las células pipeteando suavemente.
nota: El pipeteo suave es importante para mantener la salud de las células.
- Recoja la suspensión celular en un tubo cónico de 15 ml y centrifugue a 250 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
- Recoja el pellet de celda después de quitar el sobrenadante y lave las celdas volviendo a suspender el pellet en 1x DPBS.
- Gire la suspensión de celdas a una velocidad baja de 250 x g durante 5 min.
- Agregue 500 μL de DPBS y vuelva a suspender las celdas mediante un pipeteo suave para obtener una suspensión de una sola celda.
- Cuente las células utilizando un hemocitómetro o un contador de células automatizado.
nota: Para una mayor precisión, repita el conteo tres veces y tome un promedio.
- Ajuste el volumen de tal manera que la densidad final de células sea de 1 x 108 células/mL.
- Inyección subcutánea de células para desarrollar xenoinjertos de ratón
nota: Todos los procedimientos deben realizarse en un gabinete de seguridad BSL2. En el estudio actual se han utilizado ratones Athymic NudeFoxn1 nu/Foxn1+.
- Tome 50 μL de la suspensión celular en un tubo de 1,5 mL y mezcle con 50 μL de medio de matriz de membrana basal.
nota: El medio de la matriz de la membrana basal tiende a formar un estado gelatinoso a temperatura ambiente, por lo que debe mantener cuidadosamente las células y la mezcla del medio de la matriz en hielo. Es aconsejable guardar los tubos, las puntas y las jeringas en el refrigerador y luego transferirlos a hielo antes de la inyección del animal.
- Agite la mezcla para evitar la aglomeración de células. A continuación, tome estos 100 μL de la mezcla de medio de suspensión de células que contiene 5 x 106 células, en una jeringa de 1 cc.
- Levante suavemente la piel del animal para separar la piel de la capa muscular subyacente e inyecte lentamente la suspensión celular (100 μL) debajo de la piel (5 x 106 células), con una aguja de 26 G. Espere unos segundos antes de sacar la aguja, de modo que el medio de la matriz basal pueda formar la estructura gelatinosa semisólida junto con las células debajo de la piel, evitando que la mezcla salga del sitio de inyección.
nota: Las células deben ser analizadas antes de la inyección para detectar cualquier contaminación que pueda dañar a los ratones inmunodeficientes. Durante la inyección, no introduzca la aguja demasiado profundamente en la piel, ya que esto puede hacer que el tumor sea más profundo de lo esperado.
- Mantenga al animal en una jaula estéril y observe durante unos 20 minutos.
- Observe a los ratones durante 2-3 semanas y permita que el tumor crezca hasta 500mm3 de tamaño.
>4. Localización de anticuerpos mediante un sistema de imagen in vivo
NOTA: El equipo de imágenes in vivo (ver Tabla de Materiales) utilizado en este experimento utiliza un conjunto de filtros de alta eficiencia y algoritmos de desmezcla espectral para la visualización y el seguimiento no invasivos de la actividad celular y genética dentro de un organismo vivo en tiempo real. El sistema proporciona capacidad de monitoreo de fluorescencia y bioluminiscencia.
- Inyecte 25 μg de anticuerpo marcado con colorante a través de la vena de la cola.
- Anestesiar ratones portadores de tumores con isoflurano al 2%. Comprueba la falta de respuesta a los reflejos del pedal.
- Una vez que los ratones dejen de moverse, dilate la vena lateral de la cola aplicando agua de gusano.
- Inyecte 25 μg (en 100 μL) de anticuerpo marcado con una jeringa de insulina de 1 cc con una aguja de 26 G.
- Del mismo modo, como control negativo, etiquete e inyecte el anticuerpo del isotipo IgG1 no específico que no se dirige a las células cancerosas.
- Realizar imágenes en vivo in vivo después de 8, 24, 48 h, etc. de inyecciones de anticuerpos.
- En el software asociado, haga clic en Inicializar ubicado en el panel de control y confirme que la temperatura de la etapa es de 37 °C.
- Encienda el suministro de oxígeno, todas las bombas del sistema de anestesia y el suministro de gas isoflurano a la cámara anestésica, y ajuste la válvula del vaporizador de isoflurano al 2%.
- Transfiera los ratones a la cámara de anestesia y espere hasta que los ratones estén completamente anestesiados. Aplicar la pomada lubricante ocular para evitar que se sequen los ojos.
- Vaya al panel de control, configure las imágenes de fluorescencia a través de la opción Asistente de imágenes y seleccione la excitación a 773 nm y la emisión a 792 nm.
nota: Los ajustes de exposición automática predeterminados proporcionan una buena imagen fluorescente. Sin embargo, las preferencias de exposición automática se pueden modificar según las necesidades.
- Transfiera los ratones anestesiados a la cámara de imágenes y ensamble en el campo de imágenes usando un cono nasal. La etapa de imagen ofrece la opción de acomodar 5 ratones a la vez.
nota: Haga que se tomen imágenes de los ratones de control junto con los ratones de prueba para tener una cantidad similar de exposición y otros ajustes durante el análisis.
- Una vez que todo esté listo, seleccione la opción Adquirir en el panel de control para la adquisición de imágenes.
- Con los ajustes de autoexposición, el sistema genera la imagen en un minuto. La imagen generada es la superposición de fluorescencia en la imagen fotográfica con una intensidad de fluorescencia óptica que se muestra en unidades de recuentos o fotones o términos de eficiencia.
- Después de obtener la imagen, transfiera a los ratones de la cámara de imágenes a su jaula y observe su recuperación durante 1 a 2 minutos.
- Ajuste aún más la imagen con las herramientas y funciones proporcionadas en el software para el análisis de imágenes. Las herramientas de análisis de imágenes se encuentran en la barra de menú y en la paleta de herramientas.
- En Ajuste de imagen, ajuste el brillo, el contraste o la opacidad y seleccione la escala de colores.
- Utilice las herramientas de ROI para especificar una región de interés (ROI) en una imagen óptica y medir la intensidad de la señal dentro del ROI. Si es necesario, exporte los datos de la señal cuantificada a un software de hoja de cálculo y trace los datos.
- Para los estudios de seguimiento, analice las necropsias de ratones de varios tejidos (por ejemplo, hígado, pulmón, corazón, riñón, bazo, cerebro, etc.) uno al lado del otro para obtener una distribución inespecífica detallada de los anticuerpos marcados con fluorescencia.
nota: Los datos pueden respaldarse aún más con ELISA específico de tejido haciendo uso de antígeno (FOLR1 en este caso) en ensayos de 96 pocillos.
