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1. Tinción por citometría de flujo de células derivadas de monocitos infectadas con Mtb
NOTA: Los siguientes pasos deben realizarse en una instalación BSL-3. La tinción por citometría de flujo podría realizarse en una placa de 96 pocillos en lugar de tubos.
- Separe las células infectadas por Mycobacterium tuberculosis con Mtb (y los controles no infectados) de los pocillos en la(s) placa(s) de 6 pocillos mediante incubación con 1 mL de tampón FACS por pocillo durante al menos 30 min a 37 °C y 5% de CO2.
- Pipetea suavemente hacia arriba y hacia abajo unas cuantas veces para asegurarte de que las células se desprendan. Si es posible, confirme el desprendimiento de células con microscopía. Transfiera la suspensión celular de cada pocillo a un tubo de microcentrífuga con tapón de rosca y haga girar los tubos a 200 x g durante 5 minutos. Deseche el sobrenadante con cuidado mediante pipeteo.
- Lave el pellet de celdas en cada tubo dos veces con tampón FACS y centrifugue las celdas a 200 x g durante 5 min.
- Teñir las células (aproximadamente 0,5 x 106 a 1 x 106 células/tubo) con aproximadamente 50 μL de cóctel de anticuerpos antihumanos conjugados con fluorocromo, incluidos TLR2 (AF647), CD206 (APC-Cy7), CD163 (BV605), CD80 (BV650), CCR7 (BV711), CD86 (BV786), CD200R (PE), CD64 (PE-Dazzle 594), HLA-DR (PE-Cy5) (Tabla 1) en combinación con el colorante de viabilidad Zombie-UV durante 30 min a 4 °C (refrigerador) en la oscuridad.
- Lave las células teñidas dos veces con 400 μL de tampón FACS y centrije las células a 200 x g durante 5 min.
- Fije las células teñidas con 200 μL de tampón de fijación (recién preparado) durante 30 min a RT en la oscuridad para asegurar la inactivación completa de las micobacterias.
- Lave las células dos veces con 400 μL de tampón FACS y centrifugue a 200 x g durante 5 min para eliminar el exceso de tampón fijo.
- Vuelva a suspender las células fijas en 400 μL de tampón FACS y transfiera las muestras a nuevos tubos de microcentrífuga de 1 mL antes de sacarlas del laboratorio BSL-3 para la citometría de flujo en BSL-2. Almacene las células teñidas a +4 °C hasta la adquisición de la muestra.
nota: Rocíe los tubos con etanol al 70% antes de sacarlos del laboratorio BSL-3. El formaldehído es tóxico (cancerígeno) y debe manipularse en una cabina de bioseguridad de clase II. Deseche los desechos de formaldehído en un residuo químico separado.
>2. Adquisición y análisis de datos de citometría de flujo de células derivadas de monocitos infectadas con Mtb
NOTA: Los pasos 2.1–2.2 deben realizarse antes de la tinción por citometría de flujo descrita anteriormente. Para evitar problemas con la aglomeración celular y la disociación de los colorantes en tándem después de la fijación celular, la adquisición de muestras de células infectadas y no infectadas con Mtb se realiza dentro de las 4-10 horas posteriores a la tinción primaria de anticuerpos.
- Antes de la tinción por citometría de flujo descrita anteriormente, compense la señal fluorescente para cada anticuerpo conjugado con fluorocromo enumerado en el panel de tinción (Tabla 1) utilizando perlas de compensación (tanto positivas como negativas).
- Valorar la dilución de anticuerpos para la tinción de macrófagos humanos para obtener la señal óptima para cada fluorocromo.
- Utilice células no teñidas para determinar el nivel de fluorescencia de fondo necesario para establecer una puerta para la población de células negativas, lo que permite visualizar las células teñidas (los macrófagos son altamente autofluorescentes).
- Adquiera un mínimo de 50.000 células/muestra en el citómetro de flujo utilizando el software recomendado para la adquisición de datos.
- Exporte los archivos de adquisición del citómetro de flujo en formato estándar de citometría de flujo (FCS) 3.1.
- Analice los archivos FCS en el software de análisis de citometría de flujo.
- Cierre los macrófagos de acuerdo con sus características de dispersión frontal y lateral (FSC y SSC) y excluya las células muertas mediante la activación de células vivas/muertas utilizando el colorante de viabilidad Zombie-UV.
- Visualice los macrófagos infectados con H37Rv-GFP en el canal FITC.
- Identificar la frecuencia de células teñidas positivamente y la intensidad de fluorescencia media geométrica (MFI) para todos los marcadores (Tabla 1).
Tabla 1: Lista de anticuerpos utilizados para la citometría de flujo.
| láser | filtro | fluorocromo | fenotipo | función | clon | Nº de catálogo. | compañía |
| 639 | 670/30 | AF647 | TLR2 | Receptor de reconocimiento de patógenos | TL2.1 | 309714 | BioLeyenda |
| 639 | 780/60 | APC-Cy7 | CD206 | Receptor de manosa | 15-2 | 321120 | BioLeyenda |
| 405 | 610/20 | BV605 | CD163 | Receptor carroñero | GHI/61 | 333616 | BioLeyenda |
| 405 | 670/30 | BV650 | CD80 | Molécula coestimuladora | 2D10 | 305227 | BioLeyenda |
| 405 | 710/50 | BV711 | CCR7 | Receptor de quimiocinas | G043H7 | 353228 | BioLeyenda |
| 405 | 780/60 | BV785 | CD86 | Molécula coestimuladora | INFORMÁTICA2.2 | 305442 | BioLeyenda |
| 488 | 530/30 | GFP | Mtb | Bacterias intracelulares | | | |
| 561 | 586/15 | pei | CD200R | Receptor inhibidor | OX-108 | 329306 | BioLeyenda |
| 561 | 620/14 | PE/DESLUMBRAMIENTO 594 | CD64 | Receptor Fc gamma-I de IgG | 10.1 | 305032 | BioLeyenda |
| 561 | 661/20 | PE-Cy5 (PC5) | HLA-DR | Molécula MHC de clase II | L243 | 307608 | BioLeyenda |
| Artículo 355 | 450/50 | BUV395 | Tinte de viabilidad | Marcador de células vivas/muertas | Zombi UV | 423108 | Invitrogen |