Ensayo in vitro para estudiar la capacidad citotóxica de las células asesinas inducidas por citocinas

Resumen

Fuente: Hsiao, C. H., et al. Aislamiento y expansión de células T asesinas inducidas por citocinas citotóxicas para el tratamiento del cáncer. J. Vis. Exp. (2020).

Este video muestra una técnica in vitro para medir la capacidad citotóxica de las células asesinas inducidas por citocinas (CIK) contra las células cancerosas. Tras el cocultivo de células cancerosas diana con células CIK, las células cancerosas muertas se identifican utilizando un colorante fluorescente de viabilidad y se cuantifican mediante citometría de flujo, estimando el efecto citotóxico de las células CIK.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.

1. Preparación de materiales

1. Almacene reactivos, anticuerpos y productos químicos como se muestra en la hoja de datos de seguridad del material (MSDS). Disolver los fármacos o citocinas en disolventes como soluciones madre y, a continuación, alícuotas para su almacenamiento a -20 °C o -80 °C.
   nota: La información detallada para la preparación de materiales se indica en la Tabla de Materiales.

>2. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMC)

1. Calentar la solución de gradiente de densidad (Tabla de materiales) a 18-20 °C antes de usarla. Invierta el frasco de solución varias veces para asegurar una mezcla completa.
2. Recoja 3-5 mL de muestra de sangre venosa humana en un vial heparinizado y mezcle bien invirtiendo suavemente el tubo varias veces.
3. Prepare 4 mL de solución de gradiente de densidad en un tubo estéril de 15 mL.
4. Coloque con cuidado 1 ml de la muestra de sangre en la solución de gradiente de densidad.
5. Centrifugar a 400 x g durante 30 min a 18-20 °C (apague el freno).
6. Aspire con cuidado e inmediatamente la capa de capa leucocitaria de células mononucleares (aproximadamente 1 mL) de una sola vez para evitar alterar las capas en un tubo estéril de 15 mL con una pipeta estéril de 1 mL.
7. Agregue al menos 3 volúmenes (~3 mL) de solución salina tamponada con fosfato (PBS) a la capa leucocitaria en el tubo de centrífuga. Suspenda las células pipeteándolas suavemente hacia arriba y hacia abajo al menos 3 veces con una pipeta estéril.
8. Centrifugar a 400 x g durante 10 min a 18-20 °C. Aspirar el sobrenadante.
9. Suspender el pellet de celda con 5 mL de medio basal (Tabla de Materiales) y transferir a un matraz. Cultivar las células en una incubadora de cultivos celulares a 37 °C y 5% de CO₂.

3. Inducción y expansión CIK

1. El día 0, cultive las PBMC (1 x 10⁶) en medio basal fresco que contenga 1.000 UI/mL de IFN-γ durante 24 h en una incubadora de cultivo celular humidificada a 37 °C y 5% de CO₂.
2. El día 1, refresque el medio con medio basal fresco que contenga 50 ng/mL de anticuerpo anti-CD3, 1 ng/mL de IL-1α humana recombinante (rh) y 1.000 U/mL de IL-2 rh. Refresque el medio cada 3 días.
3. El día 7, refresque el medio con medio basal fresco que contenga 1,000 U/mL de IL-2 rh. Refresque el medio cada 3 días hasta el final de la expansión celular (día 14).

>4. Inmunofenotipado para la evaluación de células CIK

1. Lave las células CIK con 10 mL de PBS estéril. Centrifugar durante 10 min a 300 x g y 18−20 °C, aspirar el sobrenadante y resuspender las células con 10 mL de PBS. Cuente el número de células y pruebe la viabilidad de las células mediante el ensayo de exclusión de azul de tripano.
2. Alícuota las células CIK en seis tubos estériles de 1,5 mL a una densidad de ~5–10 x 10⁵ células/mL de PBS. Etiquete y trate de la siguiente manera: Tubo 1, en blanco (sin anticuerpos); Tubo 2, añadir 20 μL del isotipo IgG1-FITC; Tubo 3, añadir 20 μL de isotipo IgG1-APC mAbs; Tubo 4, añadir 20 μL de CD3-FITC; Tubo 5, añadir 20 μL de CD56-APC mAbs; y Tubo 6, añadir 20 μL de CD3-FITC y 20 μL de CD56-APC mAbs.
3. Mezcle suavemente las células CIK con los anticuerpos pipeteándolas suavemente hacia arriba y hacia abajo al menos 3 veces con una pipeta estéril de 1 mL, y luego incube durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
4. Centrifugar los tubos durante 10 min a 300 x g y 18-20 °C. Aspirar el sobrenadante y suspender el pellet de la célula una vez con 1 mL de PBS. Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo al menos 3 veces con una pipeta estéril de 1 ml.
5. Repita el paso 4.4.
6. Deje los tubos en la oscuridad antes del análisis citométrico de flujo.

>5. Reconocimiento de marcadores de CD

1. Transfiera la suspensión celular a un tubo inferior redondo estéril de poliestireno de 5 ml con una tapa de filtro de celdas (malla de 100 μm) pipeteando suavemente a través de la tapa. Coloque los tubos en el carrusel en orden.
2. Abra el software de análisis de citometría de flujo y cree una carpeta experimental. Haga clic en el botón Nueva muestra para agregar una muestra y un tubo al experimento y asigne un nombre a los tubos de la siguiente manera: Tubo 1, en blanco; Tubo 2, isotipo IgG1-CD3; Tubo 3, isotipo IgG1-CD56; Tubo 4, CD3; Tubo 5, CD56; Tubo 6, CD3CD56.
3. Cree un sistema de compuerta de dispersión para las poblaciones de células CIK (Figura 1A).
   1. Seleccione Tubo 1 (en blanco) y haga clic en el botón Diagrama de puntos para crear un gráfico FSC-A/SSC-A. Dibuje una puerta rectangular sobre toda la población de celdas con un umbral FSC-A >5 x 10⁴ para excluir los residuos de celdas.
   2. Seleccione el parámetro SSC-A/SSC-H para el nuevo diagrama de puntos y dibuje una puerta de polígono alrededor de todas las celdas individuales. Seleccione el parámetro Recuento/FITC (CD3) y Recuento/APC (CD56) para el nuevo gráfico de histograma, respectivamente. Seleccione el parámetro FITC (CD3)/APC (CD56) para el nuevo diagrama de puntos y dibuje una puerta de cuatro cuadrantes para definir las cuatro subpoblaciones.
   3. Registre los datos de 20.000 células individuales en cada muestra. Haga clic en el botón Cargar muestra para analizar primero la muestra de control en blanco. Identifique toda la población de células CIK mediante los parámetros de los canales CD56 y CD3.
4. Repita el paso 5.3 para la investigación de todos los especímenes.
5. Abra los archivos que contienen los valores estadísticos de la muestra individual para analizar las poblaciones de células CIK y vuelva a imprimirlos en archivos de análisis.

6. Cultivo y tinción de células K562 de leucemia mieloide crónica humana y células OC-3 de cáncer de ovario

1. Células K562
   1. Cultivar células K562 en medio completo (medio basal RPMI que contiene 10% de suero fetal bovino [FBS] y 50 U/mL de antibióticos y ajustar la glucosa a 4,5 g/L) a una densidad de 0,5−1 x 106 células/mL en un matraz de cultivo celular e incubar en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO₂.
   2. Transfiera el medio de cultivo que contiene las células K562 a tubos estériles de 50 ml y granule las células a 300 x g durante 10 minutos a 18-20 °C el día del experimento.
   3. Aspire el sobrenadante, vuelva a suspender las células en 5 mL de PBS estéril y mezcle bien suavemente.
   4. Granular las células a 300 x g durante 10 min. Aspirar el sobrenadante, resuspender las células en PBS y ajustar las células K562 a una concentración de 0,5-1 x 10⁶ células/mL.
   5. Añada 0,5 μL de colorante de éster succinimidilo de carboxifluoresceína (CFSE) a 1 mL de suspensión celular K562 en un tubo estéril de 15 mL a una concentración final de 5 μM. Mezcle suavemente la suspensión pipeteando hacia arriba y hacia abajo al menos 3 veces.
   6. Deje el tubo en una incubadora de cultivo celular a 37 °C y 5% de CO₂ durante 10-15 min.
   7. Agregue 9 mL de PBS al tubo y granule las células a 300 x g durante 10 min. Decantar el sobrenadante y luego suspender la pellet celular en 10 mL de medio completo. Transfiera la suspensión celular a un matraz de cultivo celular y colóquelo en la incubadora.
2. Células OC-3
   1. Cultivo de células OC-3 en medio completo (medio DMEM/F12 que contiene 10% de FBS y 50 U/mL de antibióticos) a una densidad de 0,5–1 x 10⁶ células en un matraz de cultivo celular a 37 °C y 5% de CO₂.
   2. Aspire el medio de cultivo y lave las células con PBS 1 día antes del experimento.
   3. Separe las células añadiendo 1 mL de solución de enzima de disociación celular (Tabla de Materiales) e incube durante 5 min a 37 °C.
   4. Suspenda las células añadiendo 5 mL de PBS y mezcle bien suavemente. Granular las células a 300 x g durante 10 min y aspirar el sobrenadante. Vuelva a suspender las células en PBS y ajústelas a una concentración de 0,5–1 x 10⁶ células/mL.
   5. Añada 0,5 μL de colorante CFSE a 1 mL de la suspensión celular OC-3 en un tubo estéril de 15 mL a una concentración final de 5 μM. Mezcle suavemente la suspensión pipeteando hacia arriba y hacia abajo al menos 3 veces.
   6. Deje el tubo en una incubadora de cultivo celular a 37 °C y 5% de CO₂ durante 10-15 min.
   7. Agregue 9 mL de PBS al tubo y pegue las células a 300 x g durante 10 min. Decantar el sobrenadante y luego suspenda la pellet de la celda con medios completos. Siembre 5 x 10⁵ células/pocillo en una placa de 6 pocillos e incube en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO₂ durante la noche.

>7. Ensayo citotóxico

1. Cocultivo de células CIK y K562 (CIK-K562)
   1. Cuente las células K562 del paso 6.1.7 y pruebe la viabilidad de la célula mediante el ensayo de exclusión de azul de tripano. Agregue 1 mL de células K562 a cada pocillo en una placa de 6 pocillos a una densidad de 5 x 10⁵/mL.
   2. Agregue 1 mL de medio basal con o sin células CIK del paso 3.4 a la placa de 6 pocillos del paso 7.1.1 de la siguiente manera: Pocillo 1 = En blanco, células K562 solas (5 x 10⁵); Pocillo 2 = células K562 teñidas con CFSE solas (5 x 10,⁵); Pocillo 3 = células CIK (E [efector], 25 x 10⁵) + células K562 teñidas con CFSE (T [objetivo], 5 x 10⁵); Pocillo 4 = células CIK (E, 50 x 10⁵) + células K562 teñidas con CFSE (T, 5 x 10⁵).
   3. Mezcle las suspensiones celulares pipeteándolas suavemente hacia arriba y hacia abajo al menos 3 veces. Coloque la placa en la incubadora durante 24 h.
2. Cocultivo de células CIK y OC-3 (CIK-OC-3)
   1. Agregue 1 mL de medio basal con o sin células CIK del paso 3.4 a la placa de 6 pocillos del paso 6.2.7 de la siguiente manera: Pocillo 1 = En blanco, células OC-3 solas (5 x 105); Pocillo 2 = células OC-3 teñidas con CFSE solas (5 x 10,⁵); Pocillo 3 = células CIK (E, 25 x 10⁵) + células OC-3 teñidas con CFSE (T, 5 x 10⁵); Pocillo 4 = células CIK (E, 50 x 10⁵) + células OC-3 teñidas con CFSE (T, 5 x 10⁵).
   2. Mezcle las suspensiones celulares pipeándolas suavemente hacia arriba y hacia abajo al menos 3 veces. Coloque la placa en la incubadora durante 24 h.
3. Tinción con colorante de 7-aminoactinomicina D (7-AAD)
   1. Recoja la suspensión celular CIK-K562 del paso 7.1.3 directamente en un tubo estéril de 15 mL.
   2. Recoja tanto las células en suspensión como las adherentes de los grupos CIK-OC-3 del paso 7.2.2.
      1. Transfiera la suspensión celular a un tubo estéril de 15 mL. Lave el pocillo con 1 mL de PBS estéril, recoja el PBS y agréguelo al tubo. Añadir 0,5 mL de solución de enzima de disociación celular e incubar durante 5 min a 37 °C.
      2. Añada 1 mL de la solución del mismo tubo al pocillo correspondiente y mezcle suavemente las células pipeteándolas hacia arriba y hacia abajo al menos 3 veces con una pipeta estéril de 1 mL. Recoge todas las células en el mismo tubo.
   3. Centrifugar a 300 x g durante 10 min, aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 1 mL de PBS estéril. Granular las células a 300 x g durante 10 min, aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 100 μL de PBS estéril.
   4. Agregue 5 μL de colorante 7-AAD (50 ng/μL de caldo) a la suspensión celular. Mezcle suavemente las células pipeteándolas hacia arriba y hacia abajo al menos 3 veces con una pipeta estéril de 1 mL. Incubar durante 10 minutos y dejar en la oscuridad antes del análisis.
4. Ensayo de capacidad citolítica
   1. Mezcle la suspensión de celdas del paso 7.3.4 y repita los pasos 5.1 y 5.2 una vez.
   2. Haga clic en el botón Nueva muestra para agregar una muestra y un tubo al experimento y asigne un nombre a los tubos de la siguiente manera: Tubo 1, solo celdas K562 (u OC-3); Tubo 2, células K562 (u OC-3) teñidas con CFSE solamente; Tubo 3, E:T = 5:1; Tubo 4, E:T = 10:1.
   3. Cree un sistema de compuerta de dispersión para el ensayo citolítico (Figura 2A).
      1. Seleccione el Tubo 1 y haga clic en el botón Diagrama de puntos para crear un gráfico FSC-A/SSC-A. Dibuje una puerta rectangular sobre todos los eventos con un umbral FSC-A >5 x 10⁴ para excluir los residuos de celda.
      2. Seleccione el parámetro SSC-A/CFSE para el nuevo diagrama de puntos. Seleccione el parámetro 7-AAD/CFSE para el nuevo diagrama de puntos y dibuje una puerta de cuatro cuadrantes para definir las cuatro subpoblaciones.
      3. Haga clic en el botón Cargar muestra para analizar primero la muestra de control en blanco.
      4. Ajuste el voltaje de SSC-A y FSC-A. Identifique la población de células muertas mediante los parámetros de canal CFSE y 7-AAD. Registre los datos de >20.000 células CFSE+ en cada muestra.
   4. Repita la sección 7.4.6 para la investigación de todos los especímenes.
   5. Abra los archivos que contienen los valores estadísticos de cada espécimen individual para analizar las poblaciones de células no viables y exportar los datos a archivos de análisis.

Resultados

Figura 1: Proporción de linfocitos T CD3⁺CD56⁺ de una muestra representativa de PBMC. (A) Los linfocitos se reconocieron por tamaño y granularidad específicos. Población de células individuales seleccionada para análisis por citometría de flujo. (B) El análisis estadístico de la eficacia de la expansión de CIK de tres donantes sanos se realizó mediante una prueba...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
7-Amino Actinomicina D	Bd	559925
Anticuerpo CD56 antihumano para ratones APC	Bd	555518	B159
Ratón APC IgG1, control de isotipo κ	Bd	555751	MOPC-21
BD FACSCanto II Citómetro de flujo	Bd	338962		SN: R33896202856
Éster de succinimidilo de diacetato de carboxifluoresceína (CFSE)	Bd	565082		Reconstritución de colorante CFSE (500 mg) con 90 mL de DMSO
Solución de D-(+)-glucosa	sigma	G8644		Para cultivo celular K562. Agregue de 12.5 mL a 500 mL de medio completo
Águila Modificada de Dulbecco Mediana/F12	HyClone	SH30023.02		Medio basal para el cultivo de células OC-3
Suero fetal bovino	HyClone	SH30084.03		Para cultivo celular K562 y OC-3. El medio completo contiene un 10% de FBS
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare Ciencias de la Vida	71101700-EK		Solución de gradiente de densidad
FITC Anticuerpo CD3 antihumano para ratones	Bd	555332	UCHT1
FITC Ratón IgG1, κ Control de Isotipo	Bd	555748	MOPC-21
AcM anti-CD3 humano	Takara	T210	OKT3	Añadir 2,5 mL de caldo (1 mg/1 mL) a 50 mL de medio de inducción. Stock de almacenamiento a -80 °C
Penicilina-Estreptomicina	Gibco	15140122		Agregue 5 mL de caldo (10,000 U/mL) a 500 mL de medio completo. Stock de almacenamiento a 4 °C.
Proleukin	NOVARTIS			Reconstitución de Proleukin Powder (22x106 UI) con 1,2 mL de agua estéril y añadir 2,7 mL a 50 mL de medio de inducción. Existencias de almacenamiento a -20 °C
Interferón gamma humano recombinante	CellGenix	1425-050		Reconstitución de IFN-g rh (5x105 UI/50 μg) con 200 μL de agua estéril y añadir de 20 mL a 50 mL de medio de inducción. Existencias de almacenamiento a -20 °C
Interleucina-1 alfa humana recombinante	PEPROTECH	200-01A		Reconstituir rh IL-1α (10 μg) con 1 mL de agua estéril y añadir de 5 mL a 50 mL de medio de inducción. Existencias de almacenamiento a -20 °C
RPMI1640 medio	Gibco	11875-085		Medio basal para cultivo celular K562. Stock de almacenamiento a 4 °C
Centrífuga Sigma 3-18K	sigma	10295
Enzima TrypLE Express	Gibco	12605028		Enzima de disociación celular; Para la desunión de las células adheridas. Almacenamiento a temperatura ambiente
X-VIVO 15 mediano	Lonza	04-418Q		Medio basal para células PBMC y CIK. Almacenamiento a 4 °C