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Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.
1. Preparación de reactivos
- Prepare la solución madre de los medios de cultivo para la recolección de tejido completo: 1 L de Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), 110 mL de Suero Fetal Bovino (FBS), 11 mL de Penicilina-Estreptomicina (concentración final 1%) y 1,1 mL de insulina esterilizada con filtro (concentración final 0,1%). Almacene la solución madre a 4 °C.
- Prepare el tampón quelante #1: 30 mL de medio de cultivo (como se describe en 1.1), 600 μL de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 0.5 M (concentración final 10 mM), 300 μL de gentamicina (concentración final 1%) y 60 μL de anfotericina B (concentración final 0.2%). Almacene la solución madre a 4 °C.
- Prepare el tampón quelante # 2: 30 mL de medio de cultivo (como se describe en 1.1), 300 μL de EDTA 0.5 M (concentración final 5mM), 300 μL de gentamicina (concentración final 1%) y 60 μL de anfotericina B (concentración final 0.2%). Almacene la solución madre a 4 °C.
- Preparar medios de miniintestino humano: 41,4 mL de DMEM/F-12, 5 mL de FBS (10% final), 500 μL de penicilina-estreptomicina (concentración final 1%), 500 μL de L-glutamina (concentración final 1%), 500 μL de gentamicina (concentración final 1%), 100 μL de anfotericina B (concentración final 0,2%), 500 μL de ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etano sulfónico (HEPES) (concentración final 10 mM), 500 μL de suplemento 100x N-2 y 1 mL de suplemento 50x B-27 menos vitamina A para un volumen total de 50 mL. Almacene la solución madre a -20 °C.
- Prepare Human Minigut Media Complete: 10 mL de Human Minigut Media (preparado en 1.4), 10 μL de 100 μg/mL Wnt3a (concentración final 100 ng/mL), 10 μL de 100 μg/mL Noggin (concentración final 100 ng/mL), 10 μL de 1 mg/mL de R-Spondin (concentración final 1 μg/mL), 10 μL de 500 μg/mL de factor de crecimiento epidérmico (EGF) (concentración final 50 ng/mL), 10 μL de N-acetilcisteína de 1 M (concentración final 1 mM), 10 μL de 10 mM Y-27632 (concentración final 10 μM), 10 μL de 500 μM A-83 (concentración final 500 nM), 10 μL de 10 mM SB202190 (concentración final 10 μM), 100 μL de nicotinamida 1 M (concentración final 10 mM) y 1 μL de 100 μM [leu] 15-gastrina 1 (concentración final 10 nM). Volumen total 10 mL. Almacene la solución madre a 4 °C.
nota: Las soluciones deben usarse dentro de las 48 horas.
>2. Aislamiento de criptas y recubrimiento de tejido completo
- En el momento de la recolección en la sala de operaciones, coloque la muestra de tejido del intestino delgado humano en solución salina tamponada con fosfato (DPBS) fría de Dulbecco. Lave la muestra con DPBS frío hasta que esté libre de heces y sangre. Almacene el espécimen a 4 °C en el medio RPMI 1640 hasta que esté listo para el aislamiento de la cripta.
nota: El pañuelo no se puede almacenar durante más de 24 horas.
- Asegúrese de que la muestra esté libre de heces y sangre. Con unas delicadas tijeras de disección, retire el exceso de grasa o las pinzas/grapas quirúrgicas, etc. Pesar la muestra.
NOTA: Apunte a una pieza de aproximadamente 0,75-2,5 g.
- Corte la muestra en trozos de 0,5 cm y colóquela en 30 mL de tampón quelante #1 (como se preparó en el paso 1.2).
- Agitar a baja velocidad durante 15 min a 4 °C.
- Filtre el tejido a través de un colador de células de 100 μm y deseche el flujo a través de él.
- Agregue el tejido a 30 mL de tampón quelante # 2 (como se preparó en el paso 1.3).
- Agitar a baja velocidad durante 15 min a 4 °C.
- Filtre el tejido a través de un filtro de células de 100 μm y deseche el flujo a través de él.
- Descongele 500 mL de matriz de membrana basal en hielo para su uso en el paso 2.8.
- Añadir un pañuelo de papel a 10 mL de DMEM frío en un tubo cónico de 50 mL y agitar vigorosamente con la mano durante 10 s.
- Filtre a través de un filtro de células de 100 μm y recoja el flujo (Etiqueta # 1). Mantenga el tubo # 1 en hielo.
- Agregue tejido a otros 10 mL de DMEM frío en un tubo cónico separado de 50 mL y agite vigorosamente con la mano durante 10 segundos.
- Filtre a través de un filtro de células de 100 μm y recoja el flujo (etiqueta # 2).
- Repita dos veces más hasta que haya cuatro tubos cónicos con flujo (tubos etiquetados # 1-4).
- Filtre la solución del tubo #1 a través de un filtro de células de 100 μm y transfiera el flujo a través de un tubo cónico de 15 mL (Etiqueta #1). Repita para # 2-4.
- Centrifugar tubos de 15 mL #1-4 a 200 x g durante 15 min a 4 °C.
- En la campana de flujo laminar, retire el sobrenadante de los tubos #1-4 y deséchelo. Evite interrumpir la nube de tejido inmediatamente encima de la bolita, incluso si eso significa dejar algo de sobrenadante.
- Pipeteando lentamente, mezcle el pellet con el sobrenadante sobrante en los tubos # 1-4.
- Transfiera la mezcla de los tubos # 1-4 a un solo tubo cónico de 2 mL.
- Centrifugar el tubo cónico a 200 x g durante 20 min a 4 °C.
- Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 500 μL de la matriz de la membrana basal.
nota: Mantenga la matriz de la membrana basal en hielo en todo momento y trabaje rápidamente para los siguientes pasos. Este producto polimeriza muy rápidamente a temperatura ambiente.
- Aplique 50 μL de suspensión de matriz de muestra/membrana basal en el centro de un pocillo en una placa de 24 pocillos. Esto debería aparecer en forma de cúpula.
nota: El uso de puntas de pipeta refrigeradas ayuda a una transferencia más suave de la suspensión, minimizando la polimerización.
- Repita 9 veces para llenar 10 pozos en total.
- Coloque la placa de 24 pocillos en una incubadora de CO2 al 5% a 37 °C durante 30 minutos para permitir la polimerización.
- Agregue 500 μL de Human Minigut Media Complete (como se preparó en el paso 1.5) a cada pocillo. Reemplace cada 2 días.
- Recoja los enteroides después de 5-10 días, cuando se visualiza la brotación. Consulte los pasos 4 y 5 para obtener instrucciones de recolección.
3. Inducción de NEC experimental
- Añada 10 μL de 5 mg/mL de lipopolisacárido (LPS) a 500 μL de Human Minigut Media Complete (como se preparó en el paso 1.5) en cada pocillo el día 0. Reemplace cada 2 días hasta la recogida.