Ensayo de adhesión in vitro para detectar la adherencia de las células cancerosas a las trampas extracelulares de neutrófilos

En este artículo

Resumen

Najmeh, S., et al. Aislamiento y manejo simplificado de trampas extracelulares de neutrófilos humanos. J. Vis. Exp. (2015)

En este video, demostramos un ensayo que utiliza microscopía de fluorescencia para detectar la adhesión de las células cancerosas a las trampas extracelulares de neutrófilos (NETs). En los pocillos de prueba, hay un aumento notable en el número de células cancerosas marcadas con fluorescencia que se adhieren a los NET, mientras que los pocillos tratados con DNasa exhiben una adhesión reducida de las células cancerosas a los NET.

Protocolo

>1. Ensayo de adhesión estática de células cancerosas NET

Añadir 100 μl del material NETO previamente obtenido por pocillo en una placa de fondo plano de 96 pocillos y dejar recubrir los pocillos O/N a 4 °C en la oscuridad.
Entre 12 y 20 horas después, verifique la formación de una monocapa uniforme de NETs libres de células en el fondo de los pocillos bajo el microscopio (Figura 1). En este punto, aspire suavemente todo el material no adherente fuera de los pocillos, asegurándose de no interrumpir la monocapa NET en la parte inferior.
Añadir 100 μl de solución bloqueante de albúmina sérica bovina (BSA) al 1% a cada pocillo y dejar actuar durante 1 h en RT.
Separe las células cancerosas A549 de un matraz T-75 con 2 ml de solución de tripsina al 0,25%. Una vez desmontado, añadir 10 ml de medio A549 a las células tripsinizadas y centrifugar a 450 x g a 4 °C durante 5 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en el medio para obtener una concentración de 2 x10⁴células cancerosas por 100 μl de medio.
nota: Las células A549 se cultivaron por separado. Brevemente, las células se cultivaron y mantuvieron en medios DMEM F12 que contenían 10% de FBS y 1% de penicilina estreptomicina y se incubaron a 37 °C 5% de CO₂. Una vez alcanzada la confluencia celular del 70-80%, se separaron utilizando tripsina-EDTA al 0,25% y se resuspendieron en los mismos medios descritos anteriormente.
Tiña las células cancerosas con CFSE añadiendo 1 μl de CFSE por ml de medio y dejándolo teñir a RT durante 10 min. Después de la tinción, centrifugar a 450 x g a 4 °C durante 5 min, luego desechar el sobrenadante y volver a suspender las células en el volumen inicial de medio para obtener una concentración de 2 x 10⁴ células cancerosas por medio de 100 μl.
Después de 1 hora de bloqueo de los NET, aspire suavemente la solución de bloqueo y agregue 2 x 10⁴células cancerosas en un medio, que equivale a 100 μl, por pocillo sobre la monocapa de NET y deje que se adhiera durante 90 minutos a 37 °C 5% CO₂. Aspire suavemente las células y añada 100 μl de PBS a cada pocillo para lavar las células no adherentes.
En algunos pocillos, agregue 1000U de ADNasa I por pocillo durante 10 minutos antes del lavado para degradar los NET. Esto servirá como un control negativo. En otros pocillos, agregue 100 μl de agua estéril por pocillo durante 10 min, que servirá como control del vehículo (VC).
NOTA: Por lo general, se realizan 3 réplicas por condición para aumentar el tamaño de la muestra.
Aspire y deseche todas las soluciones en los pocillos, dejando solo los NET y las células cancerosas adheridas en el fondo. Agregue 100 μl de solución de formaldehído al 4% por pocillo para fijar las células cancerosas adheridas a NETS y lea el ensayo bajo el microscopio de fluorescencia (Figura 1). Trazar y analizar los resultados (Figura 2).

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Resultados

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Figura 1. NET Monocapa. Las imágenes de microscopía óptica de los pocillos de placa de 96 pocillos recubiertos con NET muestran (A) una monocapa uniforme de NET en todo el pozo, en contraste con (B) un recubrimiento inadecuado del pocillo con una capa interrumpida de NET. Las barras de escala representan 40 μm.