Tinción de células bacterianas y preparación para estudios inmunológicos

Resumen

Fuente: Yang, J. et al., Detección automatizada y de alto rendimiento de la adherencia bacteriana a las células huésped.J. Vis. Exp. (2021)

Este video muestra la tinción y preparación de células bacterianas para estudios inmunológicos utilizando colorante fluorescente rojo. Las bacterias teñidas se diluyen y se resuspenden en un medio de crecimiento para lograr la concentración bacteriana deseada para la infección de la célula huésped, lo que representa la multiplicidad de la infección.

Protocolo

1. Crecimiento bacteriano y tinción

1. Realizar todo el trabajo bacteriano en un Gabinete de Bioseguridad, laboratorio de Bioseguridad Nivel 2.
2. Inocular todos los cultivos bacterianos, incluyendo Pseudomonas aeruginosa (PAO1), Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Bacillus subtilis, etc., a partir de las existencias de glicerol congeladas y cultivarlos en caldo de soja tríptico (TSB, 3 mL) en una incubadora agitadora a 37 °C durante la noche mantenida a 250 rpm.
3. Al día siguiente, utilice una dilución 1:100 del cultivo durante la noche para inocular un subcultivo y cultivarlo en TSB (1 mL) durante 3 h hasta la fase exponencial, mida la densidad óptica, OD a 600 nm (OD₆₀₀) para confirmar. Asegúrese de que el OD₆₀₀ esté en el rango de 0,4-0,6.
4. Antes de realizar el ensayo de adherencia bacteria-huésped, coloque diluciones seriadas de suspensión bacteriana en placas de agar TSB, incube durante la noche a 37 °C y luego establezca las unidades formadoras de colonias bacterianas, UFC, a partir del número de colonias. Para P. aeruginosa, una DO₆₀₀ de 1,0 corresponde a 2 x 10⁸ células bacterianas viables/mL, y para L. monocytogenes, una DO₆₀₀ de 1,0 corresponde a 9 x 10⁸ células bacterianas viables/mL.
5. Recolectar los cultivos bacterianos en fase exponencial por centrifugación a 13.000 x g durante 2 min a temperatura ambiente (RT), luego lavarlos una vez con 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS 1 mL). Vuelva a suspender los gránulos bacterianos en 1 mL de 1x PBS y determine las concentraciones midiendo el OD₆₀₀ de las suspensiones bacterianas. Por ejemplo, P. aeruginosa con OD₆₀₀ de 0,5 representa una concentración de 1 x 10⁸ células bacterianas/mL.
6. Tiñe la suspensión bacteriana con un tinte fluorescente verde o rojo en RT durante 30 minutos con una rotación suave en la oscuridad. Para ello, añada 2 μL del colorante tinte concentrado 500 veces en 1 mL de suspensión bacteriana para diluir el colorante 1 veces. Para lavar el tinte de tinción, centrifugar las bacterias teñidas a 13.000 x g durante 2 min y volver a suspender el pellet en 1 mL de 1x PBS tres veces.
   nota: Si en el experimento se utilizan bacterias marcadas con fluorescencia (proteína fluorescente verde (GFP-), proteína fluorescente roja (RFP-), mCherry, etc.), omita este paso de tinción bacteriana. En este protocolo se utilizó P. aeruginosa marcada con GFP y L. monocytogenes teñida con colorante fluorescente rojo.
7. Recoja las células bacterianas teñidas o las bacterias marcadas con GFP por centrifugación a 13.000 x g durante 2 min. Vuelva a suspender en medio F-12K fresco (1 mL) y mida el OD₆₀₀ de cada cultivo. Diluir posteriormente los cultivos hasta las concentraciones deseadas en función de la multiplicidad de infección (MOI) y la concentración de células huésped. El volumen final utilizado en este experimento es de 500 μL.
   nota: Por ejemplo, si la concentración de células huésped contada mediante la tinción con azul de tripano es de 1 x 10⁵ células/mL, la concentración deseada de células bacterianas a un MOI de 100 será de 1 x 10⁷ células/mL. La concentración de P. aeruginosa a 0,5 OD₆₀₀ es de 1 x 10⁸/mL. Para obtener la concentración deseada, diluir el cultivo de P. aeruginosa 10 veces y añadir 50 μL de cultivo resuspendido a 450 μL de medio F-12K fresco.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
10x PBS	VWR	45001-130
BactoView Live Red	Biotio	40101	Tinte antibacteriano
centrífuga	Eppendorf	5810R
E. coli			Stock de laboratorio
F-12k mediano	ATCC	302004	Medio de cultivo celular A549
Suero fetal bovino	Corning	35-016-CV
L. monocytogenes			Colecciones del NIST
OD600 DiluFotómetro	EL CASO
P. aeruginosa			Existencias de laboratorio de la Dra. Lori Burrows
P. aeruginosa ΔpilA			Existencias de laboratorio de la Dra. Lori Burrows
S. agalactiae			Colecciones del NIST
S. aureus	BEI	NR-46543
S. aureus ΔsaeR	BEI	NR-48164
S. rubidaea			Colecciones del NIST
Caldo de soja típico	Células de cultivo	MBPE-4040