Evaluación de la fosforilación de proteínas intracelulares inducida por citocinas estromales mediante citometría de fosfoflujo

Resumen

Fuente: Coats, J. S., et al. Expresión de citocinas exógenas en xenoinjertos derivados de pacientes mediante inyección con una línea celular estromal transducida por citocinas. J. Vis. Exp. (123) (2017).

Este video muestra la evaluación de la fosforilación intracelular de proteínas inducida por citocinas estromales en células de leucemia. Estas proteínas fosforiladas intracelulares se cuantifican mediante la técnica de citometría de fosfoflujo.

Protocolo

>1. Ensayos de citometría de fosfoflujo para evaluar la actividad de las citocinas producidas por el estroma

NOTA: Evalúe el sobrenadante del estroma diseñado antes del primer experimento para verificar la bioactividad relevante de la citoquina generada por el estroma para el experimento individual. Una vez que se valida el estroma modificado, no es necesario realizar más pruebas a menos que se introduzcan estromas que se produjeron con un nuevo vector.

1. Compre líneas celulares de leucemia MUTZ5 y/o MHH-CALL4 (sensibles a TSLP), citocinas humanas recombinantes y anticuerpos aprobados para su uso en ensayos de citometría de fosfoflujo para detectar objetivos de fosforilación posteriores adecuados.
2. Descongele el sobrenadante recolectado del estroma control y que expresa citocinas.
3. Coloque las líneas celulares de leucemia en medio R20 (consulte la tabla de materiales) a una concentración de 0,2 x 10⁶ células por pocillo en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos. Placa de 3 pocillos por condición para permitir ensayos por triplicado. Incubar durante 2 h a 37 °C. Este tiempo permite la pérdida de cualquier fosforilación que haya ocurrido durante las condiciones de cultivo previas.
   NOTA: 12 pocillos por línea celular proporcionan ensayos por triplicado para cada condición experimental mostrada en el paso 1.4.
4. Después de 2 h en cultivo, transfiera las células de cada pocillo a tubos separados de 4 mL y centrifugue a 500 x g durante 5 min, a 4 °C. Decantar el sobrenadante.
   1. Vuelva a suspender las células en 200 μL para cada una de las siguientes condiciones experimentales (realice ensayos por triplicado): 1) solo medios de control negativos, 2) medios de control positivos con citocina recombinante a concentraciones de saturación (TSLP a 15 ng/mL, etc.), 3) supernadante del estroma de control del estroma de control y 4) supernadante del estroma productor de citocinas.
5. Incubar las células durante el tiempo especificado por un ensayo de fosfoterapia comercial específico (por ejemplo, 30 min para phospho-STAT5 en MUTZ5 o MHH-CALL4 en respuesta a TSLP).
6. Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C y decantar el sobrenadante.
7. Realice la tinción de citometría de fosfoflujo según el protocolo del fabricante y recopile datos de citometría de flujo.
8. Analice los datos de citometría de flujo.
   1. Puerta en celdas intactas basada en la dispersión de luz directa (FSC, indica el tamaño de la celda) y lateral (SSC, indica la granularidad de la celda).
   2. Determine la intensidad fluorescente media (MFI) de las células intactas en cada muestra. Comparar el MFI promedio obtenido a partir de los valores triplicados del sobrenadante de células estromales con el de los controles de medios positivos y negativos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Pipetas serológicas de 10 mL	halcón	357551
Tubos cónicos de polipropileno de 15 mL	pescador	05-539-12
Tubos cónicos de polipropileno de 50 mL	halcón	352098
Puntas de pipeta de 1 mL	pescador	2707509
Puntas de pipeta de 200 μL	Científico de Denville	P3020-CPS
Puntas de pipeta de 10 μL	Científico de Denville	P-1096-CP
Medio de cultivo celular "R20", % del volumen total (rinde 195 mL)			Receta de laboratorio
RPMI, 76.84% (150 mL)	Tecnología de medios	10-040-CV
FBS, 20.49% (40 mL)	Tecnología de medios	35-011-CV
2 mM de L-glutamina, 1,02 % (2 mL)	Tecnología de medios	35-011-CV
1 mM de piruvato de Na, 1,02% (2 mL)
Penicilina-estreptomicina, 0,51 % (1 mL	Tecnología de medios	30-002-CL
2-Mercaptoetanol, 0,10% (0,1 M), 0,10% (200 μL)	Mp	190242
Biologics
Línea celular "CALL-4" MHH-CALL-4, leucemia precursora de células B humanas	DSMZ	ACC 337
Línea celular MUTZ-5, leucemia precursora de células B humanas	DSMZ	ACC 490
Proteína TSLP humana recombinante	Sistemas de investigación y desarrollo	1398-TS-010
Anticuerpos contra citomeria de flujo (clon)*
Antiratón CD45 FITC (30F11)	Miltenyi Biotec	Teléfono 130-102-778
CD127 PE (MB15-18C9) (el nombre alternativo es IL-7Rα)	Miltenyi Biotec	130-098-094
CD34 APC (8G12)	BD Biociencias	340667
CD45 PE-Cy7 (HI30)	eBiociencia	25-0459
"FVD" Tinte de viabilidad fijable eFluor 780	eBiociencia	65-0865
Cadena ligera Ig κ FITC (G20-193)	BD Pharmingen	555791
Cadena ligera Ig λ FITC (JDC-12)	BD Pharmingen	561379
IgD PE (IA6-2)	BioLeyenda	348203
IgM PE-Cy5 (G20-127)	BD Biociencias	551079
pSTAT5 PE, ratón anti-STAT5 (pY694)	BD PhosphoFlow	612567
Otros materiales y equipos
Software de análisis de citometría de flujo FlowJo	FlowJo, LLC	Versión 10
*Todos los anticuerpos son antihumanos a menos que se indique lo contrario.