$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
>1. Preparación de tejidos para la fijación e inclusión en parafina
NOTA: Se tomaron biopsias de mujeres que consintieron en someterse a una cistoscopia con electrofulguración de trigonitis para el tratamiento avanzado de la infección urinaria recurrente (ITUr). La ITUr se define como 3 infecciones urinarias en 12 meses. La recolección de la biopsia se realizó en el quirófano mientras el paciente estaba bajo anestesia después de obtener el consentimiento informado del paciente. Todas las muestras fueron codificadas y desidentificadas antes de la experimentación.
- Obtener una biopsia de copa fría (~1mm3) del trígono vesical con pinzas urológicas a través de un cistoscopio flexible y colocarla inmediatamente en un criovial estéril de 2 mL que contenga 1,5 mL de paraformaldehído (PFA) al 4% v/v preparado en 1x solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS).
NOTA: El 4% de PFA en 1x PBS se puede preparar con anticipación y almacenar a -20 °C hasta que se necesite.
- Fijar la biopsia durante 6 h a temperatura ambiente o durante 16-24 h a 4 °C.
NOTA: La duración de la fijación debe calcularse en función del tamaño de la muestra de tejido y debe evitarse la sobrefijación. No se aconseja el uso de glutaraldehído como fijador, ya que introduce la autofluorescencia.
- En una campana esterilizada o cabina de bioseguridad, retire el fijador mediante pipeteo y reemplácelo con 1,5 ml de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) 1x. Mantenga las muestras a 4 °C durante la noche o realice inmediatamente el procesamiento de tejidos y la inclusión en parafina.
- Utilice un micrótomo esterilizado para seccionar bloques de tejido de 5 μm de espesor y adhiera secciones de tejido de parafina a portaobjetos de microscopio de vidrio cargados. Se requerirá un mínimo de dos portaobjetos por biopsia para el protocolo de hibridación in situ (FISH) con fluorescencia de ARN ribosómico 16S (ARNr 16S).
NOTA: El tejido de la biopsia debe estar dispuesto transversalmente en relación con el plano de corte para garantizar la visualización de las capas uroteliales en todas las secciones. También debe tenerse en cuenta que el grosor de la sección debe optimizarse para la detección de la comunidad bacteriana. En el caso de infecciones en las que las bacterias residentes en los tejidos son extremadamente escasas (por ejemplo, <1 bacteria residente en los tejidos por cada 1.000 células de mamíferos) puede ser necesario tomar muestras de secciones más delgadas o muestras de múltiples secciones en series.
>2. Hibridación in situ de fluorescencia con sondas universales de ARNr 16S
NOTA: Se requieren dos portaobjetos por biopsia. Se necesita un portaobjetos para la sonda universal de ARNr 16S y un portaobjetos para una sonda de control con una secuencia codificada. Esto es importante para distinguir la señal verdadera de la señal de fondo durante la microscopía, ya que el epitelio de la vejiga es autofluorescente en múltiples canales. Además de la sonda de revuelta, el bloqueo con 0,1% de Sudan Black B antes del montaje puede reducir la autofluorescencia de fondo inherente al tejido.
- Preparación de reactivos y campana extractora
- Limpie una campana de gases vacía (o un gabinete de bioseguridad debidamente instalado) con etanol al 70%.
- Prepare el tampón de hibridación compuesto por cloruro de sodio (NaCl) 0,9 M, 20 mM de Tris (hidroximetil) clorhidrato de aminometano (Tris-HCl, pH 7,2), 0,1% de dodecil sulfato de sodio (SDS) en 10 mL de agua filtrada estéril.
NOTA: El agua filtrada estéril puede prepararse haciendo pasar agua destilada esterilizada en autoclave a través de un filtro de 0,22 μM. El tampón de hibridación se puede almacenar a temperatura ambiente, pero la SDS puede precipitar de la solución. Si el SDS precipita, caliente la solución en un baño de agua a 50 °C antes de usar.
- Prepare al menos 100 ml de etanol al 95% y al 90% en agua filtrada estéril en botellas lavadas y esterilizadas en autoclave.
- Disuelva las sondas liofilizadas marcadas con fluorescencia en 10 mM de Tris-HCl (pH 8,0) y 1 mM de tampón (TE) de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) preparado en agua sin nucleasas esterilizada por filtro hasta una concentración final de 100 μM. Prepare una dilución de 1 μM en tampón TE para su uso en este protocolo. Almacene tanto el material concentrado de 100 μM como el material de 1 μM de sondas reconstituidas a -20 °C protegidos de la luz.
NOTA: No disuelva las sondas marcadas con fluorescencia en agua. Se requiere amortiguación para evitar la hidrólisis del enlace éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) que conjuga el fluoróforo con la sonda de nucleótidos.
- Limpiar cinco frascos Coplin con etanol (EtOH) al 70%, dejar secar, etiquetar de la siguiente manera: xilenos I, xilenos II, 95% EtOH, 90% EtOH, agua bidestilada (ddH2O) y llenar con 100 mL de la solución adecuada. Esto ayudará a evitar confusiones en pasos posteriores.
- Desparafinación y rehidratación de tejidos
- En la capucha, coloque dos portaobjetos por biopsia en una gradilla de portaobjetos vertical.
- Coloque una rejilla deslizante vertical en el frasco de xilenos I Coplin (que contiene 100 ml de xilenos) durante 10 minutos.
- Retire la rejilla deslizante de xilenos I y seque la parte inferior con una toalla de papel para eliminar el exceso de xilenos. Coloque en el frasco de xilenos II Coplin durante 10 min.
NOTA: Nunca trabaje con xilenos fuera de una campana extractora certificada.
- Rehidratar secciones de tejido desparafinado en lavados sucesivos con etanol (95% y 90%) durante 10 min cada una en los frascos Coplin respectivamente etiquetados.
NOTA: Durante esta etapa, caliente el tampón de hibridación a 50-56 °C en un baño de agua.
- Retire la rejilla deslizante del lavado con etanol al 90%, seque el fondo con toallas de papel para eliminar el exceso de etanol y colóquela en el frasco ddH2O Coplin que contiene 100 ml de ddH2O esterilizado con filtro durante 10 minutos.
- Mientras espera el lavado ddH2O, diluya las sondas a 10 nM en un tampón de hibridación para crear la solución de tinción. Prepare 150 μL de solución de tinción por portaobjetos.
NOTA: Proteja la solución de tinción de la luz envolviendo los tubos en papel de aluminio y guardándolos en un cajón. Cuando trabaje con sondas marcadas con fluorescencia en la mesa de trabajo, considere apagar las luces del techo cuando pueda. Las sondas diluidas en el tampón de hibridación no deben reutilizarse.
- Hibridación y contratinción
- Prepare una cámara humidificadora para cada sonda colocando Kimwipe empapado y arrugado y agua estéril en el depósito de una caja de puntas P1000. Coloque el cartucho del soporte de la punta en la parte superior, aquí es donde se asentarán las correderas.
NOTA: Es importante utilizar una cámara humidificadora para evitar que las secciones de biopsia se sequen durante la hibridación. Cabe señalar que las cámaras humidificadoras disponibles en el mercado están diseñadas para mantener una atmósfera estable y húmeda. Sin embargo, la técnica detallada aquí controla suficientemente la humedad a un costo sustancialmente menor.
- Retire los portaobjetos de la rejilla de portaobjetos y colóquelos sobre una toalla de papel limpia (con el pañuelo hacia arriba). Use una toallita Kimwipe para secar el portaobjetos. Tenga cuidado de frotar suavemente solo cerca (no sobre) la sección de la biopsia para absorber el agua. Con una pluma hidrofóbica, dibuje un borde alrededor de la sección de biopsia y coloque el tejido del portaobjetos con el lado hacia arriba en la cámara humidificadora.
NOTA: Trabajar rápidamente para que los tejidos no se sequen antes de la hibridación.
- Coloque la cámara humidificadora en una incubadora ajustada a 50 °C. Pipetee 50-150 μL de la solución de tinción directamente sobre el tejido para llenar el rectángulo formado por el borde hidrofóbico alrededor del tejido. Tenga cuidado de no agregar demasiada solución para desbordar el borde hidrofóbico. Cierre la caja suavemente.
- Incubar durante la noche (~16 h) a 50 °C en la oscuridad. Si la incubadora tiene una ventana, cúbrala con papel de aluminio para crear un ambiente oscuro><.
NOTA: Se requiere una temperatura de hibridación por debajo de la temperatura de fusión de la sonda FISH para obtener una señal confiable. 50 °C es la temperatura óptima para la sonda universal de ARNr 16S, pero puede no ser óptima para otras sondas.
- A la mañana siguiente, prepare al menos 500 mL de tampón de lavado compuesto por 0,9 M de cloruro de sodio (NaCl) y 20 mM de Tris-HCl (pH 7,2) en ddH2O y filtre-esterilize en una botella estéril con un filtro de tapa de botella al vacío. Calentar a 50-56 °C en un baño de agua.
- Retire los portaobjetos de las cámaras de humidificación y absorba con cuidado cualquier resto de solución de hibridación con una toallita Kimwipe. Coloque los portaobjetos en una rejilla de tinción vertical.
- Coloque la rejilla de tinción en un frasco Coplin opaco que contenga 100 ml de tampón de lavado precalentado durante 10 minutos. Si los frascos de Coplin no son opacos (por ejemplo, de vidrio), colóquelos en la oscuridad durante los pasos de incubación, tal vez debajo de una caja o en un cajón.
- Repita el paso de lavado dos veces con tampón de lavado nuevo en frascos Coplin nuevos.
- Durante las fases de lavado, prepare la contramancha diluyendo una solución madre de 100 μg/ml de Hoechst 33342 1:1.000 en el tampón de lavado. Al mismo tubo, agregue Alexa-555 aglutinina de germen de trigo (WGA) a una concentración final de 5 μg/mL y Alexa-555 Phalloidin a una concentración final de 33 nM. Almacene en la oscuridad hasta que esté listo para usar.
NOTA: Hoechst, Alexa-555 WGA y Alexa-555 Phalloidin etiquetan el ácido desoxirribonucleico (ADN), la mucina/uroplaquinas y la actina, respectivamente, y pueden almacenarse a largo plazo en la oscuridad según las instrucciones del fabricante. Las etiquetas fluorescentes utilizadas para las sondas y contratinciones se pueden personalizar para los conjuntos de filtros disponibles para el microscopio que se va a utilizar.
- Retire los portaobjetos del último lavado y absorba suavemente el exceso de tampón de lavado con una toallita Kimwipe. Coloque los portaobjetos con el pañuelo hacia arriba sobre una toalla de papel y agregue 50-150 μL de contratinción directamente sobre el pañuelo para que el borde hidrofóbico se llene, pero no se desborde. Cubra hasta cuatro portaobjetos con una tapa de caja criogénica e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente.
- Vuelva a colocar los lados en la rejilla para tintar y lave dos veces más en frascos Coplin con tampón Wash fresco, durante 10 minutos cada uno.
- Seque bien los portaobjetos después del último lavado y colóquelos con el pañuelo hacia arriba sobre una toalla de papel debajo de la tapa de una caja criogénica. Exprima una gota de medio de montaje directamente sobre el tejido. Coloque con cuidado un cubreobjetos del tamaño adecuado (dependerá del tamaño de la biopsia) encima. Presione suavemente las burbujas, ya que interferirán con las imágenes y permitirán que los portaobjetos se curen durante la noche en la oscuridad.
- Al día siguiente, sella los bordes del cubreobjetos al portaobjetos con una capa ligera de esmalte de uñas transparente. Deje secar durante 10 minutos en la oscuridad y luego almacene en la oscuridad a 4 °C para la microscopía confocal.
>3. Visualización de 16S rRNA FISH por Microscopía Confocal
NOTA: Para este protocolo, los mejores resultados se logran con un microscopio confocal de barrido láser con objetivos de 63x y 100x. Se requieren conjuntos de filtros adecuados para la visualización de la fluorescencia de Hoechst, Alexa-488 y Alexa-555. Sin embargo, se puede utilizar la microscopía fluorescente estándar si no se dispone de un microscopio confocal. Este protocolo es para un microscopio confocal de barrido láser.
- Encienda el microscopio confocal y el software informático asociado con el microscopio según las instrucciones del fabricante.
- Cargue la diapositiva y visualice con el objetivo 10x en el canal azul (Hoechst). Enfoque cuidadosamente hasta que los núcleos sean visibles.
- Una vez enfocado, cambie el objetivo a un aumento alto (63x o 100x). Agregue aceite sobre el cubreobjetos. Vuelva a enfocar con el nuevo objetivo, asegurándose de que la lente del objetivo entre en contacto con el aceite mientras enfoca><.
NOTA: Utilice únicamente el enfoque fino con un aumento alto (63x o 100x). El aceite solo debe usarse para un objetivo de aceite.
- Evalúe rápidamente cada portaobjetos a través del ocular en el canal verde (proteína fluorescente verde mejorada, eGFP/Alexa-488) para determinar qué portaobjetos son positivos para FISH y cuáles son negativo>NOTA: Es mejor si esta evaluación/puntuación inicial se realiza de forma ciega por una persona separada para reducir el sesgo experimental.
- Para obtener imágenes de las biopsias teñidas, comience con un portaobjetos positivo FISH y cambie al modo de visualización por computadora. Seleccione los canales 405 (Hoechst), 488 (Alexa-488) y 555 (Alexa-555). Ajuste el agujero de alfiler utilizando el canal de longitud de onda más largo, en este caso 555. Encuentre el plano focal correcto para la visualización de bacterias marcadas en el canal 488. Sin cambiar el plano focal, ajuste la ganancia, la potencia del láser y el desplazamiento para cada canal de modo que la señal no se sature y el fondo no se corrija en exceso. Adquiera la imagen en los tres canales.
NOTA: Utilice los mismos ajustes para el canal 488 para obtener imágenes de todas las diapositivas de un experimento. La potencia del láser puede requerir un ajuste en los canales 405 y 555 si el plano focal óptimo para la visualización bacteriana cambia entre campos.