Una técnica in vitro para la generación de células T apoptóticas mediada por irradiación UV

Resumen

Fuente: Hodge, M. X., et al. Evaluación in vivo de la eferocitosis de macrófagos alveolares después de la exposición al ozono. J. Vis. Exp. (2019).

Este video muestra un método para inducir la apoptosis en las células Jurkat, una línea celular de leucemia de linfocitos T humanos. Las células están expuestas a la radiación ultravioleta C (UVC), que causa un daño extenso en el ADN y conduce a la muerte de las células apoptóticas.

Protocolo

1. Preparación de la línea celular T Jurkat (Día 2)

>NOTA: Todos los procedimientos deben realizarse en una cabina de seguridad biológica de clase II.

1. Cultivo de linfocitos T Jurkat en 24 mL de medio de cultivo basal + 10% FBS + 5% penicilina/estreptomicina a 37 °C + 5% CO₂ (Tabla de Material). Las células T Jurkat son una línea celular en suspensión que se puede mantener mediante el paso de 1:6-1:8 a medios de cultivo precalentados cada 3 días. No agitar.
2. Para preparar las células apoptóticas, hágalas crecer hasta un 90% de confluencia en cada matraz (lo que tarda 3-4 días en lograrse después del paso). Para este estudio, utilice células de cinco matraces T75 para obtener un número suficiente de células utilizadas en este protocolo.
   nota: Un matraz confluente contiene entre 20 y 24 millones de células.
3. Pipetear las células (que es el matraz completo) de cada matraz (aproximadamente 24 mL) y transferir las células a un tubo cónico estéril de 50 mL utilizando una pipeta serológica. Utilice varios tubos cónicos para varios matraces.
4. Cuente las células extrayendo una alícuota de 11 μL de células del tubo cónico de 50 mL y mezcle con 11 μL de tinción de azul de tripán y pipetee 11 μL en portaobjetos de hemocitómetro.
5. Inserte el portaobjetos en un contador de células automatizado y registre el número de células vivas para calcular el recuento total de células en cada matraz multiplicando el número de células vivas por 24, ya que cada matraz contiene 24 ml de medio.
6. Centrifugar la suspensión de la célula a 271 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT) en las celdas de pellets.
7. Deseche el sobrenadante por aspiración y vuelva a suspender el pellet de células en un medio para obtener 3,0 x 10⁶ células por mL.
8. Alícuota 5 mL de células en placas de cultivo de tejidos de 100 mm x 20 mm (se utilizarán aproximadamente nueve placas; la cantidad total de células en cada placa debe ser ~15 x 10⁶).
9. Use un plato para control / no expuesto, y los platos restantes estarán expuestos a los rayos UV.
10. Ajuste el reticulante UV al nivel de energía correcto, presione el botón de energía e ingrese "600" usando el teclado numérico, que la máquina leerá como 600 μJ / cm² x 100.
    nota: Las unidades de energía del reticulante UV están en μJ/cm² x 100; por lo tanto, para lograr 60 milijulios/^cm2, convierta las unidades para que coincidan con el reticulante UV.
11. Irradie todas las placas con celdas, sin incluir el control, a 60 milijulios (mJ)/^cm2 utilizando el reticulante UV. Retire la cubierta superior de las placas de cultivo de tejidos durante la exposición a los rayos UV, ya que la luz ultravioleta no penetrará en la cubierta de plástico.
12. Incubar todas las placas en una incubadora de cultivo celular, incluido el control no expuesto, a 37 °C al 5% de_CO2 durante 4 h.
13. Confirme la apoptosis por citometría de flujo utilizando un kit de detección de ensayo de apoptosis que contenga anexina V y yoduro de propidio (PI) (marcadores de apoptosis y necrosis, respectivamente) después de 4 h de incubación, según las instrucciones del fabricante.
    nota: La irradiación de células T Jurkat en el reticulante UV a un nivel de energía de 600 μJ/^cm2, después de una incubación de 4 h, dará lugar a que el ≥75% de las células apoptóticas (tanto tempranas como tardías) tengan un fenotipo apoptótico más temprano que el fenotipo apoptótico tardío. Esto hace que sea más fácil para los macrófagos alveolares reconocerlos y engullirlos, ya que sus membranas no están comprometidas, a diferencia de las células apoptóticas tardías, lo que lleva a un índice eferocítico más alto y a imágenes más precisas de la eferocitosis de los macrófagos alveolares en este estudio.
    1. Agrupe 333 μL (1 x 10⁶ células) de células T Jurkat de varias placas (tanto "sin UV" como "expuestas a UV") juntas para utilizarlas en tubos de análisis de compensación.
    2. Alícuota de 333 μL de células T Jurkat en tubos de citometría de flujo marcados sin teñir, sin tinción única de anexina V, sin tinción PI, sin control UV y 600 μJ/^cm2 con cromosoma de flujo marcado con rayos UV.
    3. Centrifugar los tubos a 188 x g durante 5 min a RT y decantar el sobrenadante.
    4. Lave las células resuspendiéndolas en 500 μL de solución salina fría 1x tamponada con fosfato (PBS).
    5. Centrifugar y pellets a 188 x g durante 5 min en RT. Deseche el sobrenadante después de la centrifugación.
    6. Prepare 400 μL de tampón de unión 1x por tubo de flujo diluyendo 10x tampón de unión con agua destilada mientras las células se centrifugan.
    7. Prepare el reactivo de incubación de anexina V y PI (100 μL por muestra/tubo) según las instrucciones del fabricante.
    8. Decantar el sobrenadante después de la centrifugación y volver a suspender suavemente todos los tubos en 400 μL de tampón de unión 1x, luego agregue 100 μL de reactivo de incubación de anexina V a cada tubo de muestra. Por último, añada 100 μL de tinción única de anexina V y tinción única PI a sus respectivos tubos, pero no añada nada más allá del tampón de unión 1x al tubo sin teñir.
    9. Incube los tubos en la oscuridad durante 15 minutos en RT.
    10. Centrifugar todas las células a 188 x g durante 5 min a RT y decantar el sobrenadante.
    11. Vuelva a suspender las células en 400 μL de tampón de unión 1x y, a continuación, analice las muestras para determinar la apoptosis mediante citometría de flujo. Recopile al menos 10.000 eventos por tubo para permitir una representación precisa de la tinción.
14. Combine todas las células irradiadas de las placas en un tubo cónico de 50 mL y pilas de pellets por centrifugación a 271 x g durante 5 min en RT.
15. Deseche el sobrenadante del tubo por aspiración y vuelva a suspender las células en 24 mL de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) y células de pellets por centrifugación a 271 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
16. Deseche el sobrenadante del tubo por aspiración y vuelva a suspender las células en la cantidad de PBS utilizada para dosificar ratones aprobados por IACUC. La dosis utilizada es entre 5-10 x 10⁶ células/50 μL por ratón; por lo tanto, para 10 ratones, resuspender en 500 μL (el número de células en cada dosis varía dependiendo de cuántas células se cultivan para la irradiación).
    nota: Administre al menos dos dosis adicionales para tener en cuenta cualquier líquido que pueda adherirse a los lados de la punta de la pipeta y provocar la pérdida de células.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Kit de anexina V-FITC	Trevigen	4830-250-K	El kit TACS Annexin V-FITC permite la identificación rápida, específica y cuantitativa de la apoptosis en células individuales cuando se utiliza citometría de flujo.
Células T BCL2 Jurkat	ATCC	ATCC CRL-2899	La línea celular BCL2 Jurkat se derivó mediante la transfección de células T Jurkat humanas con el vector de expresión pSFFV-neo mammalí que contiene el inserto ORF BCL-2 humano y un gen resistente a la neomicina. Ha servido para modelos de medición de la eferrocitosis.
Contador de células automatizado Countess II	Termopescador	AMQAX1000	Se trata de una plataforma de ensayo de sobremesa equipada con óptica de última generación, enfoque automático completo y software de análisis de imágenes para una evaluación rápida de las células en suspensión. Muy fácil de usar.
Citocentrífuga Cytospin 4	Termopescador	A78300003	Proporciona preparaciones económicas de capa delgada a partir de cualquier matriz líquida, especialmente fluidos hipocelulares como el líquido de lavado broncoalveolar.
Suero fetal bovino, calificado, inactivado por calor	Termopescador	16140071	Proporciona nutrientes a las células cultivadas para que crezcan. Es estándar para el cultivo celular.
Penicilina-Estreptomicina	Sigma/Aldrich	P0781-100ML	La penicilina-estreptomicina es la solución antibiótica más utilizada para el cultivo de células de mamíferos. Además, se utiliza para mantener las condiciones de esterilidad durante el cultivo celular.
RPMI 1640 Medium, Suplemento GlutaMAX	Termopescador	61870036	RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) fue desarrollado originalmente para cultivar células leucémicas humanas en suspensión y como monocapa. Desde entonces, se ha encontrado que el medio RPMI 1640 es adecuado para una variedad de células de mamíferos, incluidas HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, astrocitos y carcinomas. Ayuda a cultivar células T Jurkat de manera rápida y eficiente.
Stratagene UV Stratalinker 1800 Reticulante UV	Científico de Cambridge	Año 16659	El reticulante UV Stratalinker está diseñado para inducir la apoptosis, reticulación de ADN o ARN a membranas de nylon, nitrocelulosa o nitrocelulosa reforzada con nylon.