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>Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
1. Preparación de la muestra
- Recolectar sangre periférica en tubos heparinizados de 9 mL y mantener la muestra a temperatura ambiente (RT) en un rotor hasta que sea necesaria para el protocolo experimental.
- Etiquete los tubos del citómetro de 5 mL para controles negativos (2 tubos), controles positivos (2 tubos) y diferentes concentraciones de alérgeno/fármaco (1 tubo por cada concentración de alérgeno/fármaco analizada). Coloque los tubos en una rejilla donde los tubos encajen perfectamente sin deslizarse.
- Prepare el tampón de estimulación en agua bidestilada que contenga 2% (v/v) de HEPES, 78 mg/L de NaCl, 3,7 mg/L de KCl, 7,8 mg/L de CaCl2, 3,3 mg/L de MgCl2, 1 g/L de HSA. Ajuste el pH a 7.4 y agregue IL-3 a 2 ng/mL. Por lo general, prepare 100 mL y divida en alícuotas de 2,5 mL para congelar a -20 °C.
- Preparar controles positivos en PBS-Tween-20 0.05% (v/v) (PBS-T): Control positivo 1, N-Formil metionil-leucil-fenilalanina (fMLP) (4 μM), para confirmar la calidad de los basófilos; Control positivo 2, Anti-IgE (0,05 mg/mL) como control positivo mediado por IgE.
- Prepare el alérgeno/fármaco en PBS-T a 2 veces la concentración final deseada.
nota: Las concentraciones óptimas de alérgenos/fármacos a utilizar deben determinarse previamente mediante el uso de un amplio rango de concentraciones, mediante curvas dosis-respuesta y mediante estudios de citotoxicidad siguiendo los mismos pasos del protocolo.
>2. Preparación de la mezcla de tinción
- Añada anticuerpos monoclonales marcados con fluorocromo al tampón de estimulación siguiendo la concentración de anticuerpos recomendada por el fabricante o mediante una titulación previa de anticuerpos. En este protocolo, añadimos 1 μL de cada anticuerpo (CCR3-APC y CD203c-PE para la identificación de basófilos; CD63-FITC para la activación de basófilos) por 20 μL de tampón de estimulación.
nota: Proteja la preparación de la mezcla para tintar de la luz.
- Agregue 23 μL de mezcla para tintar a cada tubo.
>3. Estimulación sanguínea
- Añadir 100 μL de PBS-T a los tubos 1 y 2 (control negativo), 100 μL de fMLP al tubo 3, 100 μL de anti-IgE al tubo 4 y 100 μL de las diferentes concentraciones de alérgenos/fármacos a los tubos siguientes. Incubar durante 10 min a 37 °C en un baño termostático con agitación media para precalentar los reactivos.
- Agregue suavemente 100 μL de sangre a cada tubo para evitar la hemólisis. Agitar suavemente los tubos e incubar durante 25 minutos a 37 °C en un baño termostático con agitación media.
- Detenga la degranulación, manteniendo los tubos a 4 °C durante al menos 5 min.
nota: El protocolo se puede pausar aquí a 4 °C durante 30-45 min si es necesario.
>4. Lisis de eritrocitos
- Añadir 2 mL de tampón de lisado 1x a cada tubo para lisar los eritrocitos. Agite cada tubo e incube durante 5 minutos a RT.
nota: En este paso, las células se fijan debido a los agentes fijadores (formaldehído) contenidos en el tampón.
- Centrifugar a 300 x g a 4 °C durante 5 min. Decantar el sobrenadante, volcando la rejilla en un fregadero. Las células permanecen en la parte inferior de los tubos.
- Agregue 3 mL de PBS-T a cada tubo para lavar las células. Vórtice de cada tubo.
- Centrifugar a 300 x g a 4 °C durante 5 min. Decantar el sobrenadante, volcando la rejilla en un fregadero.
nota: Mantenga las muestras a 4 °C, protegidas de la luz hasta la adquisición del citómetro de flujo.
>5. Adquisición de citometría de flujo
- Adquiera muestras por citómetro de flujo (p. ej., citómetro de flujo BD FACSCalibur). Conecte el citómetro de flujo al software de la computadora y espere a que el citómetro esté listo. Cargue la plantilla y los ajustes del instrumento (Tabla 1).
- Inicie la adquisición de muestras.
- Utilice las siguientes estrategias de citómetro para la selección de basófilos activados.
- Cierre los linfocitos de la gráfica de dispersión lateral (SSC) - dispersión directa (FSC).
- Bloquear los basófilos de la población de linfocitos como células CCR3+CD203c+. Adquiere al menos 500 basófilos por tubo.
- Muestre una gráfica CCR3 - CD63 para analizar la activación utilizando CD63 como marcador de activación. Ajuste el umbral negativo de CD63 a aproximadamente 2,5% utilizando los tubos de control negativo.
- Adquiere todas las muestras.
Tabla 1: Requisitos del citómetro de flujo
| Fuentes de luz (láseres) | Láser de iones de argón refrigerado por aire Coherent SapphireTM de 488 nm; 20 mW; Láser de iones de aire JDS UniphaseTM HeNe de 633 nm; 17 mW |
| Longitud de onda excitatoria de la luz | Láser azul: 488 nm; Láser rojo: 633 nm |
| Potencia de la fuente de luz en la longitud de onda excitatoria | Láser azul: 20 mW; Láser rojo: 17 mW |
| Filtros ópticos | SSC: 488/10; FITC: 530/30, PE:585/42, APC: 660/20 |
| Detectores ópticos | FSC, SSC, FL1-H FITC, FL2-H PE, FL4-H APC |
| Detectores ópticos tye | Láser de iones de argón refrigerado por aire |
| Trayectorias ópticas | Octágono BD (línea láser de 488 nm); BD Trigons (línea láser de 633 nm) |