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1. Preparación de agujas de microinyección
- Prepare agujas de inyección capilar de vidrio de pared delgada (1,0 OD/0,75 ID) utilizando un dispositivo extractor de micropipetas con los siguientes ajustes: presión de aire 200, calor 502, tracción 90, velocidad 80, tiempo de aire 70, tiempo de aire al comienzo de la extracción 5, tiempo de aire al final de la extracción 5.
- Con unas pinzas finas, rompa la punta de la aguja estirada de modo que la abertura de la punta tenga un diámetro de aproximadamente 10 μm.
>2. Preparación de platos de inyección de larvas
- Enjuague un peine de gel con un ancho de carril de aproximadamente 4-5 mm en agua estéril y déjelo secar.
- Prepare una solución de agarosa de alto punto de fusión al 1,5-2% en medio E3 y cocine en el microondas hasta que la solución esté clara. Una vez enfriado, vierta un poco de agarosa en una placa de Petri (100 x 15 mm) y revuelva, agregando suficiente agarosa para cubrir completamente el fondo del plato.
- Una vez que la capa de agarosa se haya solidificado, coloque el peine de gel enjuagado y seco en la parte superior de modo que el extremo no peinado descanse sobre la parte superior de la placa de Petri y el extremo peinado toque la agarosa. Asegúrese de que el peine esté lo más horizontal posible, creando un ángulo de 30° con respecto a la capa inferior de agarosa.
- Vierta una pequeña cantidad adicional de agarosa en la interfaz entre el peine y la capa inferior de agarosa para que la capa de agarosa fresca cubra los pocillos del panal. Deje que se enfríe por completo antes de quitar el peine. Con la punta de una pipeta, retire los trozos de agarosa que sobresalgan de los pocillos.
- Vierta el medio E3 encima del molde de inyección y almacene a 4 °C.
- Antes de cada uso, sustituya por medio nuevo y rampas de inyección calientes a 28,5 °C durante al menos una hora antes de la inyección.
- Inmediatamente antes de las inyecciones, sustituya el E3 en la rampa de inyección por un medio E3 que contenga 200 μg/ml de 3-aminobenzoato de etilo (tricaína).
>3. Preparación del inóculo de Streptococcus iniae (S. iniae)
- Prepare y autoclave el medio de caldo Todd Hewitt suplementado con 0,2% de extracto de levadura y 2% de peptona proteosa (THY+P): 30 g/L Todd Hewitt, 2 g/L de extracto de levadura, 20 g/L de peptona proteosa. Para placas de agar, agregue 14 g / L de agar.
- Prepare cultivos bacterianos la noche anterior a las infecciones pipeteando una alícuota de 100 μl de caldo bacteriano congelado en 10 ml de caldo THY+P en un tubo sellado de 15 ml. Incubar durante la noche sin agitar a 37 °C. Después de 14-16 horas de crecimiento, use el cultivo durante la noche para hacer caldos en el congelador o prepárese para su uso en inyecciones.
- Prepare las existencias del congelador colocando 1 ml del cultivo durante la noche en 500 μl de glicerol al 80% en un tubo de centrífuga de 1,7 ml. Para evitar los ciclos de congelación y descongelación, prepare 100 μl de alícuotas de un solo uso de esta mezcla y guárdelas a -80 °C.
- En el caso de S. iniae utilizado en infecciones, diluir el cultivo nocturno 1:100 para obtener un volumen total de 10 ml de cultivo añadiendo 0,1 ml de cultivo nocturno a 9,9 ml de caldo THY+P. Crecer a 37 °C sin agitar durante aproximadamente 4-5 horas. Monitoree la densidad óptica (OD) a 600 nm utilizando un espectrofotómetro Nanodrop y recoja las bacterias en una fase logarítmica media cuando el OD600 nm alcance 0.250-0.500. Un OD600 nm de 0,250 corresponde aproximadamente a 108 unidades formadoras de colonias (UFC)/ml.
- Granular 1 ml del cultivo bacteriano en un tubo de centrífuga de 1,7 ml a 1.500 x g durante 5 min. Volver a suspender en 1 ml de solución salina fresca tamponada con fosfato (PBS) y repetir. Mida la OD600 nm de las bacterias en PBS, pellet y resuspenda en PBS para lograr la concentración deseada.
- Para ayudar en la visualización de la microinyección, agregue rojo de fenol a las suspensiones bacterianas antes de la inyección para obtener una concentración final del 0,1%.
- En el caso de los experimentos que impliquen la inyección de bacterias muertas por calor, caliente las bacterias en PBS a 95 °C durante 30 min. Confirme que el proceso de eliminación por calor redujo el número de bacterias viables a niveles indetectables mediante la siembra de un volumen de inyección (aproximadamente 1 nl) en placas sólidas de agar THY+P e incubando durante la noche a 37 °C.
>4. Etiquetado de S. iniae con un tinte fluorescente rojo CellTracker
- Para etiquetar células bacterianas vivas, prepare una solución madre de un tinte fluorescente CellTracker o equivalente. Dado que el colorante utilizado se presenta en 20 x 50 μg de alícuotas de polvo y debe resuspenderse en dimetilsulfóxido (DMSO), añada 7,3 μl de DMSO al tubo para obtener una concentración de material de 10 mM.
- Pruebe un rango de concentraciones de colorante (por ejemplo, 0,5-25 μM) en las bacterias para determinar la concentración óptima más baja que tiñe las células. Las células que se dividen rápidamente y los experimentos más largos pueden requerir una mayor concentración de tinte.
- Pellet de 1,0 ml de cultivo bacteriano en un tubo de 1,7 ml por centrifugación como se ha descrito anteriormente (sección 3). Vuelva a suspender el pellet en 1 ml de PBS fresco y añada el volumen adecuado de colorante al cultivo bacteriano.
- Incubar sin agitación a 37 °C durante 30 min. Centrifugar las bacterias y volver a suspender en 1 ml de caldo THY+P precalentado e incubar sin agitación durante 30 min más a 37 °C.
- Centrifugar las bacterias y lavarlas dos veces en PBS antes de medir el OD600 nm y diluir las bacterias para la microinyección como se detalla anteriormente (sección 3). Por lo general, inyectamos aproximadamente 100 UFC en un volumen de inyección de 1 nl para nuestros estudios de reclutamiento de leucocitos y fagocitosis.
>5. Preparación de larvas de pez cebra para infecciones
- Establezca parejas reproductoras la noche anterior y recoja los embriones como lo describe Rosen et al.Incubar los embriones en medio E3 a 28,5 °C hasta que estén listos para infectar.
- En el caso de los peces cebra que se van a fotografiar, evite el desarrollo de pigmento (melanización) añadiendo N-feniltiourea (PTU) al medio E3 a las 24 horas después de la fertilización (hpf) para una concentración final de 0,2 nM.
- En el caso de infecciones con embriones 2 días después de la fecundación (dpf), descorionar los embriones manualmente con unas pinzas finas. Alternativamente, decorionar los embriones eliminando E3 y reemplazándolos con pronasa (2 mg/ml) durante aproximadamente 5 minutos o hasta que un pipeteo suave rompa los embriones del corion. La mayoría de las larvas deberían haber eclosionado naturalmente a los 3 dpf.
- Anestesiar el pez cebra varios minutos antes de la infección colocando las larvas descorionadas en un medio E3 que contenga 200 μg/ml de tricaína.
>6. Inyección de vesícula ótica de S. iniae en larvas de tres días de edad
- Encienda el microinyector y establezca el rango de tiempo en "milisegundos". Abra la válvula del tanque de dióxido de carbono para permitir que el gas ingrese a la línea. La presión del microinyector debe ser de aproximadamente 20 libras por pulgada cuadrada (PSI). Ajuste la presión en la unidad de microinyector girando en el sentido de las agujas del reloj la perilla moleteada negra para aumentar la presión o girando en el sentido contrario a las agujas del reloj para disminuir la presión.
- Agite el cultivo de S. iniae preparado en rojo de fenol y PBS y use una punta de microcargador para cargar 2-3 μl del cultivo en una aguja de inyección capilar estirada.
- Monte la aguja cargada en un micromanipulador conectado a un soporte magnético y colóquela debajo de un microscopio estereoscópico de modo que la aguja esté en un ángulo aproximado de 45-65° con respecto a la base del microscopio.
- Presione el pedal del microinyector para dispensar una gota del inóculo en la punta de la aguja. Mida el diámetro de la gota usando la barra de escala en la lente ocular del microscopio.
- Alternativamente, calcule el diámetro de la gota inyectando un volumen en una gota de aceite mineral en un portaobjetos de microscopio de vidrio con una barra de escala. El diámetro de la gota debe ser de aproximadamente 0,10 mm, que es aproximadamente un volumen de 1 nl.
- Ajuste el tamaño de la gota ajustando la configuración de duración en el microinyector o recortando más de la punta de la aguja con pinzas finas. Tenga en cuenta que el tiempo de inyección debe ser de entre 20 y 35 mseg para evitar causar demasiado daño tisular.
- Usando una pipeta de transferencia de plástico, transfiera 12 larvas anestesiadas a cada pocillo del molde de inyección.
- Use una varilla de vidrio, un lazo para el cabello o una punta de plástico para colocar suavemente las larvas de modo que las cabezas apunten hacia la parte posterior del microscopio y los sacos vitelinos estén contra el lado izquierdo del pocillo. Apunta la oreja izquierda de la larva hacia el techo.
- Mirando a través de la lente ocular del microscopio estereoscópico, use las perillas del micromanipulador para alinear la aguja cargada con la vesícula ótica de modo que ambas estén en el mismo campo de visión. Perfore la capa epitelial externa de la vesícula ótica con la punta de la aguja para que la punta de la aguja quede justo dentro de la vesícula.
- Presione el pedal para inyectar 1 nl de la dosis deseada de S. iniae. Asegúrese de usar una presión lo suficientemente baja para no romper la cavidad. Si la inyección es exitosa, la vesícula ótica, pero no el tejido circundante, debe llenarse con el inóculo rojo de fenol (Figura 1 Ai). Retire inmediatamente cualquier pez mal inyectado de la placa de inyección.
- Retraiga con cuidado la aguja fuera de la larva y mueva la placa de inyección con la mano para que la siguiente larva esté a la vista. Haga esto con un aumento de 5X.
nota: La retracción de la aguja puede dar lugar a la deposición de algunas bacterias fuera de la vesícula ótica, lo que puede sesgar la supervivencia y los resultados del reclutamiento de leucocitos. Para evitar esto, se recomienda inyectar bacterias marcadas con tinte fluorescente y escanear visualmente las larvas inyectadas bajo un microscopio fluorescente para eliminar cualquier larva donde esto haya ocurrido. En la Figura 1 Bi se muestra una larva inyectada correctamente.
- Para asegurarse de que el volumen de inyección/inóculo permanezca igual durante el transcurso del experimento, inyecte una gota de la suspensión bacteriana en un tubo de centrífuga de 1,7 ml que contenga 100 μl de PBS estéril después de cada 48 embriones. Coloque los 100 μl en placas de agar THY+P a 37 °C durante la noche para determinar la UFC en el volumen de inyección.
- Cuando se haya inyectado todo el grupo de 12 larvas en la rampa de inyección, utilice con cuidado una pipeta de transferencia de plástico para extraer las larvas de los pocillos y colocarlas en una nueva placa de Petri (35 x 10 mm2). Retire la solución de tricaína y reemplácela con aproximadamente 2 ml de medio E3 fresco para permitir que las larvas se recuperen.
- Las larvas inyectadas con pipeta en pocillos individuales de una placa de 96 pocillos y se incuban a 28,5 °C. Monitoree las larvas a lo largo del tiempo para determinar su supervivencia en estas placas o retírelas más tarde para obtener imágenes o recuentos de UFC.
>7. Fijación de larvas para la obtención de imágenes
- Fije las larvas en una solución helada de paraformaldehído al 4% en PBS como se describe en la sección 7.
- A temperatura ambiente, lávese 3 veces durante 5 minutos cada una en PBS antes de tomar imágenes.
>8. Preparación de larvas para imágenes en vivo
- Prepare una solución de agarosa de bajo punto de fusión al 1,5% en E3 calentándola en el microondas hasta que la solución esté clara.
- Coloque la solución de agarosa en un baño de agua a 55 °C para que se enfríe pero no se endurezca.
- Añadir tricaína a la agarosa hasta una concentración final de 0,016%.
- Con una pipeta de transferencia de plástico, coloque 4-5 larvas anestesiadas en un plato con fondo de vidrio en la platina de un microscopio estereoscópico.
- Retire la solución de tricaína y agarosa del baño de agua a 55 °C y déjela enfriar a temperatura ambiente durante 1-2 minutos. Mientras la agarosa se enfría, retire la mayor cantidad posible de líquido de las larvas anestesiadas.
- Vierta la agarosa enfriada en el plato hasta que esté cubierta aproximadamente la mitad de la superficie. Agita el plato para esparcir la agarosa. Ten en cuenta que si la agarosa está demasiado caliente, matará a las larvas. Además, si se agrega demasiada agarosa a la placa, la lente del objetivo del microscopio puede golpear el fondo de la placa al enfocar a través de la agarosa.
- Con una pipeta de transferencia, recoja las larvas que hayan flotado a los lados del plato y pílelas de nuevo al centro.
- Bajo el microscopio estereoscópico, coloque suavemente las larvas como desee con un lazo para el cabello, una punta de pipeta larga o una varilla de vidrio. Para obtener imágenes de la vesícula ótica, coloque las larvas de modo que la vesícula ótica izquierda quede plana contra el fondo de la placa.
- Deje que la agarosa se enfríe durante unos 10 minutos antes de mover el plato. Las larvas pueden cambiar de posición si la agarosa no es sólida. Pipetea suavemente un poco de tricaína y una solución de E3 en la parte superior de la capa de agarosa para mantenerla húmeda.
>9. Imagen confocal de la infección
- Coloque el plato con fondo de vidrio con larvas en la platina de un microscopio invertido con un sistema confocal de escaneo láser FV-1000.
- Ajuste el agujero de alfiler a 200-300 μm y, con una lente de objetivo de apertura numérica de 0,75/20X, establezca pilas z con cortes de 3-6 μm.
- Utilice el escaneo continuo de líneas para ajustar la potencia del láser y la ganancia del detector para cada canal.
- Utilizando el barrido lineal secuencial para cada canal de fluorescencia (por ejemplo, 488 y 543 nm) y el contraste de interferencia diferencial (DIC), realice una película de lapso de tiempo de la vesícula ótica izquierda cada 3 minutos durante 2-6 horas para observar el reclutamiento inicial y la fagocitosis por neutrófilos y macrófagos. Para cursos de tiempo más largos, coloque una tapa en la placa de Petri para evitar la evaporación y el secado de la agarosa.
- Adquiera imágenes fijas de larvas fijas (Figura 1B) o vivas (Figura 2) con un aumento de 20X o 40X.
10. Fotoconversión de leucocitos marcados con Dendra2 en la vesícula ótica
NOTA: Dendra2 se puede fotoconvertir de fluorescencia verde a roja enfocando un láser de 405 nm (50-70% de potencia láser debería ser suficiente) en la región de interés (ROI) durante 1 min. A continuación se muestra el protocolo paso a paso utilizado para el sistema confocal de escaneo láser FV-1000:
- Visualice la muestra utilizando un escaneo de pila z con los láseres de 488 nm y 543 nm. Utilice el escaneo continuo de líneas para ajustar la potencia del láser y la ganancia del detector. Verifique que no haya fluorescencia roja fotoconvertida accidentalmente.
- En la ventana "Control de adquisición de imágenes", en "Configuración de estímulo", seleccione la herramienta "Usar escáner" y elija "Principal". Seleccione el láser de 405 nm y configúrelo al 70% de potencia. Usando la opción de círculo, defina el ROI en la vesícula ótica.
- En "Configuración de inicio de estímulo", seleccione "Activación en serie" con una preactivación de 1 fotograma y un tiempo de activación de 60.000 mseg. En la ventana "Configuración de adquisición" bajo el encabezado "Escaneo de tiempo", elija 2 intervalos de 00:01:00 (uno para la pre-fotoconversión y otro para la post-fotoconversión).
nota: Una vez completado el escaneo de la serie de lapso de tiempo, el Dendra2 debería haber sido fotoconvertido a su estado fluorescente rojo.
- Escanee la muestra mediante una pila z utilizando los láseres de 488 nm y 543 nm para visualizar la fluorescencia roja fotoconvertida, así como cualquier fluorescencia verde restante (Figura 3).
