Imágenes cuantitativas tridimensionales de fase para caracterizar subtipos de linfocitos

Resumen

Fuente: Yoon, J. et al. Identificación sin etiquetas de subtipos de linfocitos mediante imágenes de fase cuantitativas tridimensionales y aprendizaje automático. J. Vis. Exp.(2018)

Este video demuestra la identificación sin etiquetas de la morfología y la bioquímica de los linfocitos a través de imágenes de fase cuantitativas en 3D. Esta técnica permite un análisis exhaustivo de los linfocitos, descubriendo sus estructuras y propiedades internas sin necesidad de procedimientos de etiquetado.

Protocolo

>1. Citometría de flujo y clasificación de subtipos de linfocitos

NOTA: La clasificación de linfocitos según el tipo de célula es esencial para establecer las etiquetas de tipo de célula verdaderas (es decir, correctas) para entrenar y probar un clasificador de tipo de célula en el aprendizaje supervisado. La citometría de flujo, un método de referencia, se utiliza para identificar y separar los linfocitos.

1. Prepare una mezcla de anticuerpos de tinción de marcadores de superficie en 100 μl de medio RPMI-1640 fresco [con 10 % de FBS, 0,1 μg de CD3e (17A2), CD8a (53-6,7), CD19 (1D3), CD45R (B220, RA3-6B2) y NK1,1 (PK136)] y 0,25 μg de anticuerpos CD4 (GK1.5) para linfocitos B diana, CD4⁺ T y CD8⁺ T.
2. Añadir 100 μL de la mezcla de anticuerpos a la suspensión celular.
3. Incubar durante 25 min en hielo.
4. Lavar las células añadiendo 5 mL de PBS y centrifugar a 400 x g durante 5 min a 4 °C, dos veces.
5. Vuelva a suspender el pellet celular en 5 mL de medio RPMI-1640 fresco con 10% de FBS y 2,5 μg de DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol).
6. Recoja cada tipo de linfocito por separado con citometría de flujo utilizando los niveles de fluorescencia de los marcadores descritos anteriormente. Excluya simultáneamente las celdas muertas utilizando las señales DAPI.

2. 3D Imágenes de fase cuantitativas

1. Mantenga los linfocitos clasificados en hielo durante todo el procedimiento de imagen, que debe completarse dentro de las 5 horas (desde el aislamiento de los linfocitos del ratón) para evitar daños celulares y alteraciones bioquímicas.
2. Seleccione un tipo de célula ordenada (entre linfocitos B, CD4⁺ T y CD8⁺ T) y diluya la muestra a 180 células/μL con medio RPMI para obtener condiciones de imagen óptimas (es decir, una célula por campo de visión).
3. Cargue 120 μL de la muestra diluida en una cámara de imagen mediante inyección lenta. Compruebe minuciosamente la presencia de burbujas en la cámara de imagen con la muestra. Si hay burbujas, retírelas con cuidado, ya que comprometerán la calidad de las mediciones.
4. Adquiera tomografías RI 3D utilizando un microscopio de fase cuantitativo 3D comercial, u holotomografía, y su software de imágenes.
   NOTA: En el manuscrito original se puede encontrar información detallada sobre la configuración experimental.
   1. Coloque una gota de agua destilada encima de la lente del objetivo del microscopio.
   2. Coloque la cámara de imágenes con la muestra en la etapa de traslación del microscopio y ajuste su ubicación para que la muestra se alinee con la lente del objetivo.
   3. Ajuste las posiciones axiales de las lentes del objetivo y del condensador haciendo clic en Enfoque y Superficie, respectivamente, en la pestaña "Calibración" de la perspectiva "Microscopio" del software de imágenes.
   4. Alinee el objetivo y las lentes de condensador haciendo clic en Modo automático. Alternativamente, use el modo de escaneo y ajuste manualmente las lentes para que los patrones de iluminación se localicen en la región central del campo de visión.
   5. Vuelva al modo normal y ajuste la etapa de traslación para localizar una celda en el campo de visión.
   6. Encuentre el plano focal ajustando la posición axial de la lente del objetivo. El enfoque perfecto hace que el límite de la muestra visualizado en la pantalla sea casi invisible.
   7. Ajuste la etapa de traducción para buscar una ubicación sin celda.
   8. Haga clic en Calibrar para medir varios hologramas 2D con diferentes ángulos de iluminación.
   9. Ajuste la etapa de traslación para ubicar una celda en el centro del campo de visión.
   10. Vaya a la pestaña "Adquisición" y haga clic en Instantánea 3D para medir los hologramas de la celda con ángulos de iluminación idénticos como se hizo en el paso 2.4.8.
   11. Cuando los datos adquiridos se presenten en el panel "Gestión de datos", haga clic con el botón derecho del ratón sobre los datos adquiridos y haga clic en Procesar para reconstruir un tomograma RI 3D a partir de los hologramas medidos en los pasos 2.4.8 y 2.4.10, utilizando el algoritmo de tomografía de difracción implementado en el software de imágenes.
   12. Repita los pasos 2.4.5-2.4.11 para medir más de 100 celdas y garantizar la potencia estadística para el aprendizaje automático.
   13. Se pueden visualizar todas las imágenes que se procesan a través del paso 2.4.11. En el panel "Gestión de datos", haga clic con el botón derecho en los datos y haga clic en Abrir para visualizar los datos. Haga clic en Tomograma RI en el panel "Administrador de datos". En la pestaña "Preset", haga clic en Cargar y haga doble clic en "lymphocyte.xml", que es una función de transferencia predefinida proporcionada por el software de imágenes para visualizar el tomograma de acuerdo con las distribuciones RI 3D.
5. Repita los pasos 2.2-2.4 para medir las tomografías IR 3D de todos los subtipos de linfocitos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Citometría de flujo	BD Biociencias	Aria II o III
Cámara de imagen	Tomocube, Inc.	TomoDish
Holotomografía	Tomocube, Inc	HT-1H
Software de imágenes de holotomografía	Tomocube, Inc.	TomoStudio
Software de procesamiento de imágenes	Obras de matemáticas	Matlab R2017b
Tubo centrífugo cónico Falcon	ThermoFisher Scientific	14-959-53A	15 mL
Solución salina tamponada con fosfato	Sigma-Aldrich	806544-500ML
Tampón de lisado de amonio-cloruro-potasio	ThermoFisher Scientific	A1049201
RPMI-1640 medio	Sigma-Aldrich	R8758
Suero fetal bovino	ThermoFisher Scientific	10438018