Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto
1. Extracción de sangre de los pacientes
>PRECAUCIÓN: Tome las medidas de seguridad de laboratorio adecuadas al recolectar sangre completa del paciente. Use guantes y gafas. Si el paciente está en aislamiento, siga los procedimientos de nivel 4 de bioseguridad.
- Para recolectar sangre entera intravenosa del paciente, use una aguja de mariposa con un tubo de extensión de pequeño diámetro y un tubo de vacío de extracción de sangre que contenga un tampón de lisis/unión. Apoye el brazo del paciente en una posición hacia abajo y coloque el tubo de recolección más abajo que la aguja de mariposa. Inserte la aguja de mariposa en la vena del paciente y conecte el tubo de vacío de extracción de sangre a la extensión de diámetro pequeño.
nota: Esto evitará el reflujo.
- Después de la extracción de sangre, mezcle el contenido del tubo volteándolo de 5 a 10 veces.
nota: Debido al vacío restante en el tubo de extracción de sangre que contiene 1,6 mL de tampón de lisis/unión, el volumen de la muestra recogida será automáticamente de 1,6 mL.
- Desinfecte el exterior del tubo con etanol al 70%.
- Incubar los tubos durante 20 min a temperatura ambiente.
nota: El protocolo se puede pausar aquí y los tubos de extracción de sangre llenos se pueden almacenar a -20 °C, 5 °C, 25 °C o 37 °C durante al menos 1 mes.
- Continúe directamente con el método de extracción NA simplificado.
>2. Extracción simplificada de la sangre entera
- Para purificar la NA de la sangre recolectada inactivada por tampón de lisis/unión, mezcle el contenido del tubo volteando el tubo de vacío con la mano 5 - 10 veces.
- Retire la tapa del tubo con cuidado y descargue la tapa.
- Vierta la alícuota preparada de MGP (1 mL) directamente en el tubo de extracción de sangre.
- Coloque una tapa nueva de un tubo de recolección de sangre sin usar en el tubo que contiene la muestra.
- Coloque un dedo en la tapa para asegurarse de que el tubo esté bien cerrado y mezcle el contenido del tubo volteando el tubo de recolección de sangre con la mano de 5 a 10 veces.
- Coloque el tubo en el soporte magnético y mantenga un dedo en la tapa para asegurarse de que el tubo esté bien cerrado.
- Voltee el soporte magnético con el tubo varias veces con la mano para asegurarse de que todos los MGP se recojan en el lado del tubo con el imán.
nota: El soporte magnético se puede sustituir por un imán alargado y una banda elástica.
- Retire la tapa del tubo y deseche el contenido del tubo utilizando una pipeta desechable o simplemente vertiendo el contenido en un tubo de recolección de 50 ml.
nota: Evite los aerosoles del tubo de recolección de 50 ml cerrando el tubo con una tapa.
- Vierta la alícuota preparada de tampón de lavado-1 (WB-1, 4 mL) directamente en el tubo de extracción de sangre.
- Coloque la tapa en el tubo y coloque un dedo en la tapa para asegurarse de que el tubo esté bien cerrado.
- Retire el tubo del soporte magnético, manteniendo la tapa bien apretada con un dedo.
nota: Si utiliza un imán y una banda elástica, simplemente retire la banda elástica y el imán del tubo.
- Vuelva a suspender los MGP volteando el tubo de recolección de sangre con la mano de 5 a 10 veces.
- Repita los pasos 2.6 a 2.8.
- Vierta la alícuota preparada de WB-2 (1,5 mL) directamente en el tubo de extracción de sangre.
- Coloque la tapa en el tubo y retire el tubo del soporte magnético.
nota: Si utiliza un imán y una banda elástica, simplemente retire la banda elástica y el imán del tubo.
- Coloque un dedo en la tapa para asegurarse de que el tubo esté bien cerrado.
- Vuelva a suspender los MGP volteando el tubo de extracción de sangre durante unos segundos con la mano.
- Repita los pasos 2.6 a 2.8.
- Vierta la alícuota preparada de WB-3 (3 mL) directamente en el tubo de extracción de sangre.
- Coloque la tapa en el tubo y retire el tubo del soporte magnético.
nota: Si utiliza un imán y una banda elástica, simplemente retire la banda elástica y el imán del tubo.
- Coloque un dedo en la tapa para asegurarse de que el tubo esté bien cerrado.
- Vuelva a suspender los MGP volteando el tubo de recolección de sangre con la mano de 5 a 10 veces.
- Repita los pasos 2.6 a 2.8.
- Vierta la alícuota preparada de tampón de elución (EB, 100 μL) directamente en el tubo de extracción de sangre.
- Coloque la tapa en el tubo y retire el tubo del soporte magnético.
nota: Si utiliza un imán y una banda elástica, simplemente retire la banda elástica y el imán del tubo.
- Vuelva a suspender los MGP en el JE golpeando el tubo de extracción de sangre de 5 a 10 veces con un dedo.
nota: Aquí se puede pausar el protocolo y los tubos se pueden almacenar a -20 °C.
- Transfiera una gota (5 - 8 μL) de los MGP resuspendidos a la mezcla de reacción de amplificación de NA aguas abajo utilizando una pipeta desechable de 1,5 mL (se puede utilizar cualquier ensayo de amplificación de NA de diagnóstico posterior, como la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP)/LAMP de transcripción inversa (RT-LAMP) o los ensayos de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR)/RT-qPCR)
nota: Los NA se adherirán a los MGP, así que asegúrese de usar los MGP en la reacción de amplificación de NA posterior. Mezcle la suspensión MGP antes de usar. Después de mezclar, los MGP se acumularán en el fondo del tubo.
