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1. Preparación de liposomas
- Calcule la cantidad de soluciones madre suspendidas con cloroformo de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) y 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-cap biotinil (Biotina-PE) para producir existencias diluidas a la concentración final deseada. Para obtener concentraciones finales de 400 μM de DOPC y 80 μM de fosfolípidos de biotina-PE a 10 ml cada uno, comience colocando 629 μl de 10 mg/ml de DOPC y 88 μl de 10 mg/ml de biotina-PE en tubos de cromatografía de vidrio separados.
NOTA: es importante limpiar las jeringas Hamilton de vidrio y los tubos de cromatografía de vidrio con una solución de limpieza (1 L de etanol al 95% por 120 ml de agua que contenga 60 g de hidróxido de potasio, KOH) mientras se transfiere la solución madre suspendida con cloroformo de DOPC y Biotina-PE.
- Seque el cloroformo con un chorro de argón en la campana química. Selle el tubo de cromatografía con parafilm.
- Someta los liposomas recién secados a un alto vacío en un liofilizador durante la noche (O/N) para eliminar cualquier cloroformo residual. Para completar el mismo día, seque durante 60-90 min.
- Mientras funciona el liofilizador, prepare un poco de tampón de dilución. Para este protocolo, prepare 25 ml que consisten en 25 mM de Tris, pH 8.0; 150 mM de NaCl; y detergente al 2% (en peso) de n-octil-β-D-glucopiranósido (OG). Mezcle primero los dos primeros ingredientes, luego desplace el oxígeno con argón antes de agregar el polvo seco de OG. Después de la preparación, filtre la solución OG con una membrana de acetato de celulosa de 0,2 micras y almacene a 4 °C.
- Además, prepare dos frascos con tapa de rosca de 1 L de tampón de solución salina Tris a las mismas concentraciones, pero sin OG. Coloque una barra magnética de agitación limpia con agua destilada en la parte inferior de cada uno. Prepare 6 litros adicionales del tampón Tris-salino. Retire el oxígeno de todas las botellas con argón y colóquelas también a 4° C.
- Después de la liofilización, disuelva los lípidos secos en el tampón Tris-salino OG para hacer una solución de 4 mM de cada uno. Siguiendo los volúmenes de ejemplo, agregue 2 ml al tubo de DOPC y 0,2 ml al tubo de Biotina-PE.
- Mezclar los lípidos de biotina-PE con los lípidos DOPC. Esto mejora la movilidad del SLB, ya que la biotina acoplada puede afectar la fluidez de los grupos principales de fosfato. Para obtener una concentración final de 80 μM de biotina-PE, mezcle 0,2 ml de 4 mM de biotina-PE y 1 ml de 4 mM de DOPC. A continuación, añadir 8,8 ml del tampón Tris-saline OG.
- Para obtener una concentración final de 400 μM de DOPC, basta con mezclar 1 ml de 4 mM de DOPC con 9 ml de Tris-saline OG.
- Llene el sonicador con agua helada. Coloque el tubo de vidrio que contiene el fosfolípido diluido en el centro del sonicador utilizando una pinza utilitaria. Sonicar el fosfolípido diluido durante 10 min hasta que la solución se vuelva clara.
nota: Añada hielo en el baño de agua del sonicador para mantener la temperatura baja, ya que la sonicación generará calor.
- Rellene los tubos con argón para desplazar el oxígeno en el aire del líquido y séllelos con parafilm.
>2. Diálisis de liposomas
- Corte dos secciones de tubo de diálisis seco (corte de peso molecular: 12-14.000, diámetro: 6,4 mm) de la longitud adecuada (en este ejemplo, 40 cm), una para cada dilución de fosfolípidos, del rollo.
- Rehidrate las secciones del tubo dejándolas remojar en 200 ml de agua destilada en un vaso de precipitados de vidrio durante 2 min.
- Cocine esto en el microondas durante 5 minutos a temperatura alta, o al menos hasta que el agua hierva.
- Haz un nudo en un extremo de cada tubo y enjuaga el interior con unos mililitros de tampón Tris-saline-OG. A partir de entonces, exprima meticulosamente la mayor cantidad posible de este tampón de lavado para minimizar la cantidad de tampón que queda en el interior.
- En una campana de flujo laminar, agregue los fosfolípidos diluidos en cada tubo y sujete los extremos abiertos con un pequeño cierre de tubo de diálisis para excluir todo el aire. La exclusión completa del aire requerirá el sacrificio de un pequeño volumen de la muestra mediante la fijación por debajo de la "línea de flotación".
- Sumerja las muestras en los frascos previamente preparados de tampón de solución salina Tris sin OG. Desplazar el oxígeno de la botella con argón antes de volver a sellar y colocar para remover O/N a 4°C.
- Transfiera el tubo a una nueva botella de tampón de solución salina Tris sin OG cada 12 h durante al menos 3 veces.
- Poco antes de la extracción de los lípidos dializados, prepare una serie de pequeños tubos en los que alícuota los lípidos llenando cada uno de ellos con argón para desplazar el oxígeno.
- Después de 36 h, coloque los biberones de diálisis en la campana de flujo laminar y retire los tubos de diálisis de los biberones. Tenga a mano un pañal de banco o un vaso de precipitados para recoger la escorrentía húmeda.
- Corte el tubo de diálisis por encima de la pinza, luego retire la pinza y transfiera con cuidado la solución lipídica dializada a través de una pipeta a alícuotas de 1 ml en tubos preparadas previamente llenos de gas argón en hielo.
- Alicuone la solución acuosa de liposomas y use la corriente de argón para desplazar el oxígeno nuevamente en cada tubo.
- Almacenar los liposomas a 4°C. No congelar.
>3. Aislamiento y cultivo de células NK humanas
- Alicuócuota 15 ml de sangre periférica o leucocitismo en un tubo cónico de 50 ml. Diluya esta sangre con solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenga un 1% de suero fetal bovino (FBS) en una proporción de 1:1.
- Añadir 13 ml de Ficoll suavemente al fondo del tubo con una pipeta serológica de 10 ml.
- Centrifugar este tubo durante 20 minutos a 1.200 x g con el acelerador y la ruptura o en sus ajustes más bajos.
- Después de la centrifugación, use una pipeta serológica para recolectar la capa intermedia flotante de color blanco turbio de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC), que debe ubicarse en la intersección entre una capa superior de color amarillo claro y una capa inferior más turbia de color pálido, las cuales se encuentran sobre una capa inferior de glóbulos rojos (RBC). NOTA: No recoja ningún glóbulo rojo al recoger los PBMC.
- Coloque las PBMC recolectadas en un nuevo tubo cónico de 50 ml y diluya hasta su capacidad con PBS que contenga 1% de FBS. Vuelva a centrifugar, esta vez con el freno y el acelerador al máximo, durante 5 minutos a 300 x g.
- Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 10 ml de PBS que contengan 1% de FBS.
- Cuente las células mientras centrifuga una vez más con la misma configuración que en el paso 3.6.
- Deseche el sobrenadante una vez más y vuelva a suspender las células en medio R10 a una densidad de 10 millones de células/ml.
- Tome 30 millones de células en un tubo de poliestireno de 5 ml y aísle las células NK utilizando un kit de separación magnética, siguiendo las instrucciones del fabricante. Después del aislamiento, cuente las células una vez más y vuelva a suspender a una densidad de 500.000 células/ml en medio completo R10 (88% medio del Roswell Park Memorial Institute, RPMI; 10% FBS; 1% N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etano ácido sulfónico, HEPES; 1% piruvato de sodio) suplementado con IL-2 (100 U/ml). Cultive a 37° en una incubadora de CO2 y reemplace el medio 2-3 veces por semana.
>4. Montaje de la bicapa lipídica plana soportada por vidrio
- Prepare 100 ml de solución de piraña mezclando peróxido de hidrógeno al 30% con ácido sulfúrico en una proporción de 1:3 en un vaso de precipitados.
nota: Siempre realice trabajos con agentes nocivos como el ácido sulfúrico en una campana de gases químicos debidamente designada.
- En esta solución, sumerja 2 cubreobjetos rectangulares #1.5 en solución de piraña durante 20-30 min.
nota: Es imprescindible limpiar los cubreobjetos con una solución de piraña.
- Mientras se limpian los cubreobjetos, tome 1 tubo de 400 μM de lípidos DOPC previamente preparados y 1 tubo de 80 μM de lípidos Biotin-PE previamente preparados. Transpórtalos en hielo al tanque de argón.
- Desplace el oxígeno en un nuevo tubo de microcentrífuga con argón, luego agregue el DOPC y la biotina-PE en una proporción de 1:1. El volumen específico variará en función de las necesidades experimentales, pero debe ser de un mínimo de 2 μl cada uno. Vuelva a desplazar el oxígeno del tubo de mezcla con gas argón, así como los tubos de reactivos individuales, antes de devolver este último al frigorífico.
- Una vez que hayan terminado de limpiar, enjuague bien los cubreobjetos con agua destilada. Deja que los cubreobjetos se sequen al aire durante unos minutos.
- Extraiga 1,5 μl de la mezcla de liposomas preparada en el paso 5.4 y alícuota en una sola gota en una de las cámaras de carril del portaobjetos de la cámara. El uso de 2 gotas por carril es típico, pero no necesario.
- Coloque rápida y eficazmente el cubreobjetos seco sobre las gotas. Asegúrese de que las gotas estén lo suficientemente espaciadas para que no se fusionen una vez que se coloque el cubreobjetos. Además, asegúrese de que las gotas permanezcan circulares y bien definidas, sin tocar los bordes de las paredes de la cámara. Presione firmemente entre y alrededor de cada carril para asegurar un sello hermético entre el cubreobjetos y la corredera.
- Marque las posiciones de las gotas con un rotulador.
- Pase 100 μl de caseína acuosa al 5% a través de la cámara para bloquear la bicapa. Trate de asegurarse de que no haya burbujas en la cámara de flujo.
- Inyectar 100 μl de estreptavidina a una concentración de 333 ng/ml en cada vía. Incubar durante 10-15 min a temperatura ambiente (RT). A continuación, lávese pasando 3 ml de solución salina tamponada con HEPES (HBS)/albúmina sérica humana (HSA) al 1% a través de cada carril para eliminar el exceso de estreptavidina.
- Agregue 100 μl de anti-CD16 biotinilado marcado con fluorescencia, como Alexa Fluor 568, a la concentración de proteína que se determinó previamente que era más efectiva. Incubar en la oscuridad durante 20-30 min. Lavar de nuevo pasando 3 ml de HBS/1% HSA por cada carril.
- Hacer fluir 100 μl de D-biotina a una concentración de 25 nM a través de la cámara para unirse a cualquier exceso de estreptavidina y eliminar así la posibilidad de una unión inespecífica de estreptavidina a las células.
- Cuente las células NK y vuelva a suspender a una concentración de 500.000/ml en HBS/1% HSA.
- Mientras centrifuga las células, lave la D-biotina fuera de la cámara con otros 3 ml de HBS/1% HSA por carril.
- Comprobar la movilidad de los ligandos en el SLB mediante la recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo (recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo, FRAP) en una fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) o microscopía confocal antes de añadir células NK.
- Una vez que las células hayan terminado de girar y se hayan resuspendido a la concentración deseada, agregue 100 μl a cada carril.
- Coloque la cámara en una incubadora de 37° 5% CO2 durante 30-60 min.
- Después de este período de incubación, fije las células con paraformaldehído al 4% en RT durante 10-20 min. Lave pasando 3 ml de PBS por cada carril para eliminar el paraformaldehído.
- Añadir 400 μl de tampón bloqueante (5% de suero de burro normal y 0,2% de Triton X-100 en PBS). Incubar en RT durante 30 min.
- Teñir la F-actina y la perforina añadiendo 200 μl de faloidina diluida marcada con fluorescencia (1 unidad/ml de faloidina marcada) y anticuerpo monoclonal antiperforina marcado con fluorescencia (500 ng/ml de mAb antiperforina). Incubar en RT durante 1 hora.
- Lavar con 3 ml de PBS. La cámara está lista para la toma de imágenes.
>5. Imagen de la sinapsis NK en bicapa lipídica usando STED
- Encienda todos los módulos de hardware necesarios.
- Inicie el software de análisis de imágenes. Habilite los módulos de escaneo resonante y STED. Después de realizar estas selecciones, espere unos 3-5 minutos para que se inicie el software.
- Haga clic en la pestaña "Configuración" en la parte superior de la pantalla.
- Seleccione "Configuración de láser" y luego encienda la luz blanca y los láseres STED de 592 nm.
- Elija el objetivo 100x y alinee el rayo láser de excitación con el láser de agotamiento de 592 nm.
- Seleccione el módulo "Configuración de láser", apague el láser de agotamiento 592 y encienda el láser de agotamiento de 660 nm.
- Coloque la diapositiva sobre el escenario, sobre la lente. Enfoca las células unidas en la región bicapa demarcada con la lámpara de luz blanca y los oculares.
- Regrese a la pestaña "Adquisición", directamente a la derecha de la pestaña "Configuración".
- Haga clic en la pestaña "Cambiar a luz blanca", luego encienda ese módulo y arrastre la línea del láser de excitación a la longitud de onda adecuada.
- Seleccione el detector deseado de la lista de los disponibles, luego configure el rango de detección para abarcar el rango apropiado de longitudes de onda.
nota: NUNCA coloque el rango de detección directamente debajo del haz de excitación.
- Haga clic en el botón "Seqential" en la barra de herramientas "Adquirir" de la izquierda para que aparezca el cuadro de diálogo de escaneo secuencial en la parte inferior de la barra de herramientas de la izquierda. Esto permite al usuario agregar múltiples secuencias, cada una con un haz de excitación diferente para un color diferente. Haga clic en "Entre fotogramas" y, a continuación, establezca la frecuencia de excitación, el detector y el rango de detección para cada color adicional como en los pasos 5.9 y 5.10.
- Una vez que todas las configuraciones estén optimizadas, presione "Iniciar" para comenzar el proceso de adquisición.