Imágenes de superresolución de la formación de sinapsis inmunológica de células NK en una bicapa lipídica soportada

Resumen

Fuente: Zheng, P., et al. Imágenes de superresolución de la sinapsis inmunológica de células asesinas naturales en una bicapa lipídica plana soportada por vidrio. J. Vis. Exp. (2015).

Este video muestra una técnica para visualizar la formación de la sinapsis inmunológica en células asesinas naturales (NK) en una bicapa lipídica (SLB) soportada. El SLB se marca primero con un ligando del receptor activador de células NK marcado con fluoróforos, seguido de la incubación con células NK. Posteriormente, las células se tiñen para obtener actina polimerizada y gránulos líticos perforin-positivos. Este enfoque permite la visualización de la formación de sinapsis mediante microscopía de agotamiento de emisiones estimuladas (STED).

Protocolo

1. Preparación de liposomas

1. Calcule la cantidad de soluciones madre suspendidas con cloroformo de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) y 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-cap biotinil (Biotina-PE) para producir existencias diluidas a la concentración final deseada. Para obtener concentraciones finales de 400 μM de DOPC y 80 μM de fosfolípidos de biotina-PE a 10 ml cada uno, comience colocando 629 μl de 10 mg/ml de DOPC y 88 μl de 10 mg/ml de biotina-PE en tubos de cromatografía de vidrio separados.
   NOTA: es importante limpiar las jeringas Hamilton de vidrio y los tubos de cromatografía de vidrio ....

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
18:1 (Δ9-CIS) PC (DOPC) 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina	Avanti	850375C	Preparación de liposomas
18:1 Tapón de biotinyl PE 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(cap biotinyl) (sal sódica)	Avanti	870273C	Preparación de liposomas
Gas argón comprimido	Gases aéreos	UN1006	Preparación de liposomas
Un liofilizador	Labconco	Zona franca 7740020	Preparación de liposomas
Tubos liofilizadores	Labconco	7540200	Preparación de liposomas
Columnas de cromatografía	Santa Cruz	SC-205558	Preparación de liposomas
1 M Tris pH 8.0	Ambiente	AM9856	Preparación de liposomas
5 M de NaCl	Ambiente	AM9759	Preparación de liposomas
Octil-β-D-glucopiranósido	Sigma-Aldrich	O1008	Preparación de liposomas
Tubos de diálisis	Laboratorios de espectro	132676	Preparación de liposomas
Placa de poliestireno con fondo en V de 96 pocillos (sin tratar)	Corning	3896	Determinación de la densidad de anticuerpos
Perlas de sílice no funcionalizadas	Laboratorios Bangs	SS06N	Determinación de la densidad de anticuerpos
Tubos FACS	Fisher Científico	14-959-2A	Determinación de la densidad de anticuerpos
Cuentas QuantumTM MESF	Laboratorios Bangs	variable	Determinación de la densidad de anticuerpos
caseína	Sigma-Aldrich	C0875	Preparación de bicapas lipídicas
Solución salina tamponada HEPES + 1% HSA	casero		Preparación de bicapas lipídicas
Estreptavidina	Tecnologías para la vida	434301	Preparación de bicapas lipídicas
Proteína biotinilada marcada con fluorescencia	casero		Preparación de bicapas lipídicas
ibidi Sticky-Slide VI 0.4	Ibidi	80608	Preparación de bicapas lipídicas
Cubreobjetos de vidrio de 25x75 mm	Ibidi	10812	Preparación de bicapas lipídicas
Peróxido de hidrógeno (30%)	Fisher Scientic	BP2633	Preparación de bicapas lipídicas
ácido sulfúrico	Sigma-Aldrich	258105	Preparación de bicapas lipídicas
D-Biotina	Invitrogen	B20656	Preparación de bicapas lipídicas
Papel para lentes	VWR	54826-001	Para la obtención de imágenes
Aceite de inmersión tipo F	Leica	11 513 859	Para la obtención de imágenes
Un microscopio Leica TCS STED	Leica		Para la obtención de imágenes