Ensayo de citotoxicidad mediada por células asesinas naturales Preparación de muestras para análisis de citometría de flujo

Resumen

Fuente: McBride, J. E., et al. Análisis Citométrico de Flujo de la Actividad Lítica de las Células Asesinas Naturales en la Sangre Entera Humana. J. Vis. Exp. (2017).

Este video demuestra la actividad lítica de las células asesinas naturales contra las células diana teñidas con fluorescencia. El método permite la medición de la citotoxicidad inducida por células NK mediante la tinción de células muertas y el uso de un citómetro de flujo para cuantificar las células diana vivas y muertas.

Protocolo

1. Preparación de controles

1. Transfiera lo siguiente a tubos de 1,5 ml separados y debidamente etiquetados:
   1. Agregue 500 μL de IMDM fresco que contenga células K562 marcadas con DiO resuspendidas en el tubo de 1,5 mL marcado con "Doble Positivo".
   2. Agregue 500 μL de IMDM fresco que contenga células K562 marcadas con DiO resuspendidas en el tubo de 1,5 ml marcado con "DiO only".
   3. Agregue 500 μL de IMDM fresco que contenga células K562 resuspendidas y no marcadas en el tubo de 1,5 mL marcado con "Yoduro de propidio (PI) solamente".
2. Coloque los tubos Doble Positivo y PI solo en un baño de agua a 55 °C durante 5 min.
3. Una vez transcurridos los 5 minutos, retira los tubos y límpialos con etanol al 70%.
4. Agregue 10 L de PI a los tubos Doble Positivo y PI solo 1,5 mL.
5. Coloque los tres controles de celdas objetivo K562 en la incubadora a 37 °C durante 30 min.
6. Una vez transcurridos los 30 minutos de incubación, centrifugar los tres controles de células objetivo K562 durante 2 minutos a 163 x g.
7. Retire con cuidado el sobrenadante sin alterar la pelletización de la celda.
8. Vuelva a suspender cada control con 20 μL de medios de cultivo celular IMDM frescos y déjelo en la incubadora a 37 °C con 5% de CO₂ durante al menos 30 minutos para obtener una señal DiO óptima
   nota: Los controles ahora están listos para ser ejecutados a través del citómetro de flujo de imágenes.

>2. Preparación de la muestra del ensayo de citotoxicidad

1. Prepare y etiquete los tubos de 1,5 ml para cada muestra/participante según corresponda.
2. Pipeta deseaba la proporción de células NK y células K562 marcadas con DiO en cada tubo.
   NOTA: Por ejemplo, la proporción deseada de células diana K562 y células efectoras NK es de 1:5.
3. Centrífuga durante 5 min a 135 x g.
4. Retire con cuidado el sobrenadante sin alterar la pelletización de la celda.
5. Resuspenda la mezcla de células K562 marcadas con NK-DiO en 500 μL de medios de células NK sin interleucina-2 (IL-2) y 2-mercaptoetanol (2-ME) (medios de cultivo de células NK incompletos)
   NOTA: El medio de cultivo celular NK incompleto es el Medio Esencial Mínimo Eagle con bicarbonato de sodio, sin L-glutamina, ribonucleósidos y desoxirribonucleósidos.
6. Agregue 5 μL de PI a cada tubo.
7. Centrífuga durante 2 min a 163 x g.
8. Incubar las células a 37 °C durante 2 h.
9. Después de 2 h de incubación, centrifugar durante 2 min a 163 x g.
10. Retire con cuidado el sobrenadante sin alterar la pelletización de la celda.
11. Resuspenda las células en un medio de cultivo de células NK incompleto de 25 μL.

>3. Preparación de la muestra espontánea ("S")

1. Pipetee 500 μl de células K562 marcadas con DiO (concentración de 1 x 106 células/mL) en un tubo de 1,5 mL.
2. Agregue 10 μL de PI a cada tubo.
3. Tubo de centrífuga durante 2 min a 163 x g.
4. Incubar las células a 37 °C durante 2 h.
5. Después de 2 h de incubación, centrifugar durante 2 min a 163 x g.
6. Retire con cuidado el sobrenadante sin alterar la pelletización de la celda.
7. Vuelva a suspender las células en medios de cultivo celular de 25 μl de medio esencial alfa mínimo (α-MEM) incompletos.

>4. Adquisición de datos con citómetro de flujo de imágenes

1. Presione el botón verde dentro de la puerta frontal del citómetro de flujo de imágenes para encender el instrumento.
2. Encienda todas las computadoras asociadas con el citómetro de flujo de imágenes.
3. Inicie el software del citómetro de flujo de imágenes.
4. Haga clic en el botón "Inicio" para vaciar el sistema y preparar la línea de muestreo.
5. Una vez que se complete el "Inicio", cierre la ventana "Calibraciones".
6. Asignar canales: en la parte superior izquierda, haga clic en cada canal para asignarlos.
7. En el lado derecho, haz clic en el botón de diagrama de dispersión para crear 4 diagramas de dispersión: Raw Max Pixel _MC_6 vs Area_M06, Raw Max Pixel _MC_2 vs Area_M02, Raw Max Pixel _MC_5 vs Area_M05 y FieldArea_M01 vs AspectRatio_M01.
8. Comience a analizar las muestras utilizando primero el control "Doble positivo".
   1. Haga clic en "Cargar".
   2. Coloque el tubo de 1,5 ml con la muestra "Doble Positiva" de los pasos 1.4 a 1.8 en el cargador de muestras.
   3. Seleccione el objetivo 40X en la pestaña "Ampliación".
   4. Encienda los láseres de 405 mW y 642 mW.
   5. Encienda el canal "Campo claro".
   6. Haz clic en "Seleccionar intensidad".
   7. Sobre la base de la muestra de control "Doble positivo", determine la intensidad deseada para el láser de 405 mW para que el detector no se sobrecargue.
      nota: Por ejemplo, la intensidad óptima para este experimento se estableció en 11 mW.
9. Una vez lograda la configuración deseada, adquiera los datos.
   1. En la pestaña "Adquisición de archivos", introduzca un texto de nombre de archivo personalizado. Seleccione una carpeta para guardar los archivos de datos.
   2. Introduzca el número de casillas a adquirir junto a "Recoger". Por lo general, este número varía entre 1.000 y 10.000.
   3. Haga clic en "Adquirir"
      NOTA: Una vez que se adquiere el número deseado de celdas, el archivo de datos se guarda automáticamente en la carpeta seleccionada anteriormente.
10. Una vez finalizada la adquisición, cargue la siguiente muestra de control: solo control DiO.
    1. Haga clic en "Cargar".
    2. Coloque el tubo de 1,5 mL con la muestra "Solo DiO" en el cargador de muestras.
    3. Deje seleccionado el objetivo de 40X en la pestaña "Ampliación".
    4. Deje encendido el láser de 405 mW.
    5. Apague el láser de 642 mW y el canal "Brightfield><". NOTA: Ahora que se ha logrado la configuración deseada, se pueden adquirir los datos.
    6. En la pestaña "Adquisición de archivos", introduzca un texto de nombre de archivo personalizado y seleccione una carpeta para guardar los archivos de datos. Introduzca el número de casillas que desea adquirir junto a "Recoger". Normalmente, este número es de 1.000.
    7. Haga clic en "Adquirir"
       nota: Una vez que se obtiene el número deseado de celdas, el archivo de datos se guarda automáticamente en la carpeta seleccionada anteriormente.
11. Repita el paso 4.10 para la muestra de control "PI solamente". Las muestras experimentales ya están listas para ser recolectadas.
12. Manipule las muestras experimentales restantes, incluidas las "Muestras 'S' espontáneas" de la siguiente manera:
    1. Deje seleccionado el objetivo de 40X en la pestaña "Ampliación".
    2. Encienda los láseres de 405 mW y 642 mW.
    3. Encienda el canal "Campo claro".
    4. Haz clic en "Establecer intensidad".
    5. En la pestaña "Adquisición de archivos", introduzca un texto de nombre de archivo personalizado y seleccione una carpeta para guardar los archivos de datos. Introduzca un texto de nombre de archivo personalizado.
    6. Ingresa el número de celdas a adquirir junto a "Recoger".
    7. Haga clic en el botón "Adquirir".
       nota: Una vez que se obtiene el número deseado de celdas, el archivo de datos se guarda automáticamente en la carpeta seleccionada anteriormente.
13. Repita el paso 4.12 para todas las muestras experimentales.
14. Una vez que se hayan recopilado todos los datos y archivos experimentales, haga clic en el botón "Apagar" para esterilizar el sistema.

>5. Análisis de muestras de citómetro de flujo de imágenes

1. Abra la aplicación de software de análisis de citómetro de flujo por imágenes.
2. En "Archivo", abra un experimental. Archivo RIF.
3. Construya una nueva matriz usando un solo color. RIF (control de solo DiO y control de solo PI, creados durante los pasos 4.10 y 4.11) seleccionando "Crear una nueva matriz" en la pestaña Compensación en el software del citómetro de flujo de imágenes.
   NOTA: El software solicitará la selección de los archivos de un solo color y los fusionará para crear un archivo de matriz (extensión de archivo .ctm), que se seleccionará para aplicar la compensación de canal.
4. Cree diagramas de puntos utilizando la función "bloques de construcción" del software.
   1. Cree un diagrama de puntos (BrightFieldGradient_RMS vs frecuencia) para controlar las celdas enfocadas. Llame a la puerta "Focus" (Figura 1A).
   2. Usando la puerta "Enfoque", cree un diagrama de puntos de Área de campo claro frente a Relación de aspecto de campo claro para bloquear las celdas singlete. Llame a la puerta "Única" (Figura 1B).
   3. Usando la puerta "Única", cree un diagrama de puntos de Intensity_MC_Ch02 frente a Intensity_MC_Ch5. Utilice este gráfico para identificar y controlar las células DiO positivas (objetivos, vivas) y las células PI-DiO dobles positivas (objetivos, muertas) (Figura 1C).
      nota: Todos los gráficos descritos en los pasos 5.4.1, 5.4.2 y 5.4.3 se pueden crear utilizando la función "bloques de construcción" del software.
5. Haga clic en la función de estadísticas del diagrama de puntos para acceder a los números de celda de cada puerta.
6. Calcule el porcentaje de blancos muertos en la muestra espontánea y en las muestras experimentales utilizando la siguiente fórmula:
   % de objetivos muertos en la muestra = (#dead objetivos x 100)/(#live objetivos + #dead objetivos)
7. Calcule la citotoxicidad utilizando la siguiente fórmula:
   % citotoxicidad = [(Muertos experimentales-Muertos espontáneos)/(100-Muertos espontáneos)]x100

Resultados

Figura 1: Histogramas representativos, diagramas de dispersión e imágenes para el análisis de la actividad citotóxica. (A) análisis de células focales. (B) análisis de una sola célula. (C) análisis de tinción de células diana. Todas las determinaciones se realizan utilizando la imagen adjunta a cada evento. Se puede acceder a esto en el software de a...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Linfoblastos K-562	ATCC	CCL-243
Medios de comunicación modificados de Iscove	ATCC	30-2005	Alta glucosa, con L-Glutamina, con HEPES, Filtrado estéril
Alfa Mínimo Esencial medio	ATCC	CRL-2407	Sin ribonucleósidos y desoxirribonucleósidos pero con 2 mM de L-glutamina y 1,5 g/L de bicarbonato sódico
Solución de tinción de yoduro de propridium	BD Pharmingen	51-66211E
Solución de etiquetado celular Vybranto DiO	Vybranto	V-22886
Citómetro de flujo por imágenes ImageStream X Mark II
Sangre entera CD56 MicroBeads, humano	Miltenyi Biotec	130-090-875
Citómetro de flujo por imágenes ImageStream X Mark II	EMD Millipore
Cuentas de velocidad	Corporación Amnis	400030
Software INSPIRE	EMD Millipore	Versión Mark II, septiembre de 2013
Software de aplicación de ideas	EMD Millipore		Versión 6.1, julio de 2014