Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
1. Preparación general del PCLS humano y posterior exposición a productos químicos
NOTA: Se requieren dos personas para llenar un pulmón. Se recomienda tener un registro de vacunación actualizado contra la hepatitis A y B. Los pacientes se someten a pruebas rutinarias de detección del VHC y el VIH antes del trasplante de pulmón. Si se diagnostica o se sospecha una infección activa por Mycobacterium tuberculosis, se debe rechazar el pulmón. No obstante, todo el tejido pulmonar humano fresco y las muestras derivadas de él deben tratarse como potencialmente infecciosos, y deben adoptarse las medidas de protección correspondientes (mascarillas con filtro de partículas (FFP2), gafas protectoras, guantes) para garantizar la seguridad laboral del personal. El procedimiento dura de 60 a 90 min.
- Confirmar la integridad del lóbulo pulmonar humano.
nota: Un desgarro en la pleura impide el llenado homogéneo del tejido. El material pulmonar humano debe ser del día de la resección. Se toleran períodos de almacenamiento de aproximadamente 2 h a temperatura ambiente (RT) antes de llenarlo con agarosa en hielo. El tejido que utilizamos en este protocolo se obtiene de pacientes sometidos a resección. No es de pacientes fallecidos. Si el tejido se ha almacenado en hielo, precaliéntelo a RT antes de llenarlo, de lo contrario, la agarosa se polimerizará inmediatamente y no será posible un llenado homogéneo.
cautela: Asegúrese de que todas las personas que estén en contacto con material humano nativo se pongan ropa protectora que consista en una bata de laboratorio, dos pares de guantes, una gorra, una mascarilla y un par de gafas de seguridad. El material humano es potencialmente infeccioso.
- Pesar 7,5 g de agarosa poco gelificante y añadirla a 250 mL de agua bidestilada. Hervir la agarosa en el microondas hasta que se disuelva. Enfriar a aproximadamente 40 °C, dependiendo del punto de fusión y gelificación de la agarosa.
nota: Se requieren varios frascos, dependiendo del tamaño del lóbulo.
- Precalentar y mantener el medio de cultivo (Tabla de Materiales) a 37 °C.
nota: Si la agarosa está demasiado caliente, las vitaminas en el medio de cultivo perderán efectividad y las células se dañarán. Si la temperatura de la solución de medio/agarosa es inferior a 37 °C, se iniciará el proceso de gelificación y se verá afectado por el llenado homogéneo del pulmón. Solo se recomienda un rango de temperatura de 37 °C a 39 °C.
- Coloque todos los materiales necesarios al alcance de la mano antes de comenzar: 5 a 10 pinzas, un catéter flexible de aproximadamente 1 m de longitud, una jeringa adecuada (por ejemplo, 50 ml) que ajuste la conexión al catéter y una nevera llena de hielo.
- Cánula la tráquea/bronquio principal insertando el tubo de silicona y fijándolo con una pinza orientada paralelamente al tubo, de modo que la pinza apriete el tejido a lo largo del tubo de silicona sin pellizcarlo. Verifique que el tubo de silicona esté fijado en el interior y no pueda salirse durante el procedimiento de llenado. Cierre todos los demás bronquios, vasos sanguíneos y lesiones con pinzas, para que no se escape agarosa durante el procedimiento de empaste.
- Mezcle un volumen equivalente de agarosa de baja gelificación al 3% con medio de cultivo en un vaso de precipitados. Instilar la mezcla en el pulmón con una jeringa de 50 ml. Antes de volver a llenar la jeringa con medio, cierre el catéter con los dedos o con una pinza para evitar burbujas de aire y reflujo de agarosa. Llene el lóbulo pulmonar hasta que esté completamente inflado. Toque con cuidado la pleura pulmonar en el costado; La pleura debe ser uniforme y dura.
nota: Dependiendo del tamaño del lóbulo pulmonar, se pueden requerir hasta 2 o 3 L de solución de agarosa/medio.
- Repita los pasos 1.5 a 1.6 para cada bronquio en el caso de varios bronquios dentro de una sola muestra.
- Ponga el pulmón en hielo para la polimerización de la agarosa en gel durante 20 a 40 minutos, dependiendo de la cantidad de agarosa instilada. Toque con cuidado la pleura en varios lados para verificar si está dura y fría, lo que indica que la polimerización está completa, de lo contrario, continúe esperando. Deje que los patólogos corten el pulmón en rodajas, tomen sus muestras y almacenen el material pulmonar en hielo para su transporte.
- Corte el tejido pulmonar humano en losas de 3 a 5 cm con un cuchillo afilado.
nota: Use una cuchilla nueva para cada pulmón para garantizar el afilado.
- Llene la cortadora de pañuelos con 400 ml de solución salina equilibrada de Earle's helada (EBSS). Corte inmediatamente los núcleos de tejido cilíndricos de las losas pulmonares con un destornillador semiautomático con una herramienta de extracción de muestras del diámetro preferido (por ejemplo, 8 mm; 10 mm).
nota: Este diámetro debe ser equivalente al diámetro del soporte de papel tisú dentro de la máquina.
- Ajuste el grosor de las rodajas de pulmón al valor de grosor deseado.
nota: Un espesor de aproximadamente 250 μm se usa comúnmente en experimentos de PCLS. El fabricante de la cortadora de pañuelos recomienda su Medidor de espesor de rebanadas de papel para verificar el grosor de la rebanada. Alternativamente, se puede utilizar la tinción de montaje completo combinada con microscopía confocal para determinar el grosor del corte.
- Transfiera los núcleos de tejido al soporte de tejido de la cortadora de tejidos. Coloque el peso (parte del soporte de tejido) encima del núcleo de tejido. Ajuste la velocidad del brazo y la velocidad de la cuchilla a 6 en la cortadora de pañuelos. Comience a cortar el núcleo del tejido en PCLS.
- Suplemento 500 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM): Mezcla de nutrientes F-12 DMEM/F12 (1:1) con 5 mL de penicilina (10,000 unidades/mL) y estreptomicina (10,000 μg/mL). Almacene el medio de cultivo durante varios días en condiciones estériles en un refrigerador. Precaliente solo el volumen requerido del medio.
nota: La penicilina se inactivará si se mantiene a 37 °C durante períodos más largos. Utilice un medio de cultivo sin suero y sin colorantes, ya que la composición del suero varía de un lote a otro, y los colorantes, como el rojo de fenol, pueden interferir con los ensayos.
- Llene una placa de Petri (100 x 15 mm) con 25 mL de medio de cultivo helado. El medio debe drenarse de la cortadora de pañuelos y colocarlo en un vaso de precipitados abriendo la abrazadera del cilindro de vidrio. Transfiera las rodajas de un vaso de precipitados a la placa de Petri con medio de cultivo utilizando un aplicador (p. ej., asa de inoculación). Coloque la placa de Petri en una incubadora (37 °C, 5% CO2, 100% humedad). Deje que el medio se caliente antes de los pasos de lavado.
nota: Todos los pasos posteriores se realizan en condiciones estériles.
- Coloque un colador de células en la placa de Petri para lavar el PCLS. Retirar completamente el medio de cultivo con una pipeta serológica de 10 mL a través del colador de células y añadir 25 mL de medio fresco precalentado a 37 °C. Repita este paso 3 - 4 veces cada 30 min.
nota: El colador de células evita que las lonchas sean succionadas por la pipeta, para evitar cualquier daño a las rodajas.
- Transfiera las rodajas de pulmón con cuidado a una placa de cultivo de 24 pocillos con un mínimo de 500 μL de medio de cultivo para dos rodajas por pocillo.
nota: Para la transferencia, preferiblemente use un asa de inoculación y deje que las rodajas floten en el asa para evitar daños en los tejidos. No es necesaria una mayor separación de las rebanadas, ya que solo una escasez de suficiente medio fresco inducirá la muerte celular en las rebanadas de tejido. Las rodajas pueden superponerse o tocarse entre sí en el pocillo: esto no influye en la viabilidad del tejido.
