Ensayo basado en fluorescencia que utiliza linfocitos modificados genéticamente para el cribado de compuestos inmunomoduladores

Abstract

Fuente: Fouda, A., et al., A Ensayo de linfocitos basado en fluorescencia adecuado para el cribado de alto rendimiento de moléculas pequeñas. J. Vis. Exp., (2017).

Este vídeo muestra el cribado de compuestos inmunomoduladores mediante un ensayo basado en fluorescencia. Los linfocitos T transgénicos derivados de ratones con casetes de expresión de proteínas fluorescentes verdes se tratan con estos compuestos. Las señales de GFP aumentadas y reducidas permiten identificar los efectos estimulantes e inhibidores de los compuestos, respectivamente.

Protocol

>1. Preparación del medio de esplenocito y tampón de citometría de flujo

1. Realice todos los pasos bajo una cubierta biológica limpia con etanol al 70%.
2. Retire 70 ml de medio precalentado Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 1x (disponible comercialmente y suministrado en frascos estériles filtrados de 500 ml de volumen) y colóquelo en un tubo estéril. El medio eliminado se utilizará más adelante en el protocolo.
3. Complemente los 430 mL restantes de RPMI 1640 1x con 50 ml de suero fetal bovino inactivado (FBS), 5 mL de penicilina/estreptomicina, 5 mL de ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etano sulfónico (HEPES), 5 ml de aminoácidos no esenciales, 5 mL de piruvato de sodio y 0,05 mL (1M) de 2-mercaptoetanol filtrado.
   nota: Precalentar el medio esplenocitario con un baño de agua a 37 ºC para evitar el choque térmico de las células. Esto es importante para evitar la inducción de la apoptosis celular.
4. Para preparar el tampón de citometría de flujo, agregue 2 mL de FBS a 98 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y manténgalo refrigerado hasta su uso (preferiblemente dentro de los tres días).

>2. Generación de suspensión de células de esplenocitos a partir de bazos de ratón^{Nur77 GFP}

1. Aísle asépticamente el bazo de una hembra de ratón Nur77^GFP de 6-8 semanas de edad.
   1. Para lograr esto, trabaje bajo una campana estéril. Remoja la piel de ratón, las tijeras y las pinzas sacrificadas en etanol al 70%.
   2. Coloca el ratón sobre su lado derecho y corta la piel y los músculos del cuadrante abdominal superior izquierdo. Inspeccione el área de la incisión para ubicar visiblemente el bazo y luego córtelo. Mantenga el bazo en medio de esplenocito en hielo hasta que esté listo para realizar el siguiente paso.
2. Coloque el bazo en una placa de Petri de cultivo celular de 10^cm2 que contenga 5 ml de medio esplenocitario precalentado.
3. Machaca el bazo con un émbolo de jeringa estéril hasta que la solución esté turbia. Al final del procedimiento, debe quedar una matriz de colágeno en el bazo.
4. Después de una maceración extensa en medio de esplenocitos, recoja la suspensión celular y pásela a través de un filtro celular de 70 μm colocado en un tubo de 50 ml para filtrar cualquier residuo o coágulo.
5. Centrifugar a 500 x g durante 5 min. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet de células en 2-3 mL de tampón de lisis de glóbulos rojos producido internamente o comercial. Después del pipeteo (2-3 veces), deje reposar la suspensión durante 20-30 s.
6. Añada 5 mL de PBS o un tampón adecuado de su elección y, a continuación, centrifugar la suspensión celular durante 5 min a 500 x g.
7. Retire el sobrenadante (debe ser de color rojo ya que contiene glóbulos rojos lisados) y vuelva a suspender el pellet de células en 2 ml de medio esplenocitario.
8. Con un hemocitómetro, cuente el número de células teñidas con azul de tripán para diferenciar entre células vivas y muertas (necróticas).

>3. Aislamiento de células T de la suspensión de células esplenocitarias

1. Centrifugar la suspensión celular durante 5 min a 500 x g. Vuelva a suspender las células en medio RPMI sin suero (50 ml a partir del paso 1.3) para obtener una concentración celular de 10 x 10⁶ células/mL.
2. Transfiera las células a un tubo de poliestireno de 5 ml y reserve una alícuota de 100 μl de esplenocitos para la evaluación/comparación de la pureza al final de la etapa de purificación.
3. Agregue suero de rata normal a la suspensión celular a 50 μL/mL seguido de un cóctel de anticuerpos de aislamiento de células T (50 μL/mL).
4. Mezclar la suspensión celular y dejar reposar durante 10 min. Este paso permite que el cóctel de anticuerpos se una a todas las células no deseadas.
5. Agregue las esferas rápidas de estreptavidina (perlas magnéticas) durante 2,5 minutos, luego aumente el volumen a 2,5 ml usando el medio sin suero.
6. Coloque el tubo en un imán de aislamiento de celdas durante 3 min.
7. Transfiera la suspensión de células T a un nuevo tubo de poliestireno sosteniendo el imán y vertiendo la solución en un solo movimiento.
   nota: La suspensión aislada contiene las células T purificadas. Todas las células no deseadas se mantienen en el lado del tubo unidas a las perlas magnéticas de estreptavidina.
8. Cuente las células T aisladas con azul de tripán y un hemocitómetro.
   nota: En este paso, se puede verificar la pureza de las células T aisladas (opcional) analizando el porcentaje de eventos de CD3⁺ antes y después del aislamiento de las células T mediante citometría de flujo.
   1. Brevemente, centrifugar 1 ml de suspensión de células de esplenocitos a 500 x g. Deseche el sobrenadante y suspenda las células en un tampón de citometría de flujo a una concentración de 1 x 10⁶ células/mL.
   2. Añadir anticuerpo anti-ratón CD3 marcado con fluorescencia a una concentración de 1:100. Incubar a 4 °C durante 30 min. Lavar una vez, centrifugar y volver a suspender en tampón de citometría de flujo (400 μL) para el análisis por citometría de flujo.

>4. Activación de células T y la inducción de la expresión de la proteína verde fluorescente (GFP)

1. Siembre las células T, en suspensión, en una placa de fondo redondo de 96 pocillos a una concentración de 2,5 x 10⁵ células/pocillo.
2. Agregue interleucina (IL)-7 recombinante a 2 ng/mL y perlas magnéticas CD3/CD28 (25 μL/10⁶ células). Mantenga una parte de las células T sin tratar con perlas para que sirva como control negativo para mediciones posteriores que representen células T no activadas.
3. Doce horas más tarde, recoja las células T de la placa de 96 pocillos pipeteando suavemente la suspensión celular en cada pocillo hacia arriba y hacia abajo para romper cualquier complejo/agregado de células de perla. Recoja la suspensión de todos los pocillos en un tubo de poliestireno de 5 mL.
4. Coloque el tubo que contiene la suspensión dentro del mismo imán de aislamiento celular utilizado anteriormente para la purificación de las células T y déjelo reposar durante 5 min.
5. Transfiera la suspensión de células T a un nuevo tubo de poliestireno sosteniendo el imán y vertiendo la solución en un solo movimiento.
6. Centrifugar las células a 500 x g durante 5 min. Vuelva a suspender las células en medio de esplenocitos frescos para obtener una concentración de 2 x 10⁶ células/mL.
7. Evaluar la intensidad de la expresión de GFP mediante citometría de flujo (opcional para el control de calidad) a las 12 a 24 h después de la estimulación en comparación con las células T no activadas. ¹²
   nota: La fluorescencia de GFP es intrínseca a las células T^GFP Nur77 y se manifiesta tras la activación exitosa del receptor de células T, TCR.
8. Para la evaluación de la viabilidad y la activación (opcional) por microscopía, tiñir las células activadas con Hoechst 30 min antes del análisis a una concentración de 0,2 μg/ml. Añadir un volumen adecuado de la suspensión celular a un portaobjetos de cubierta o a un pocillo de una placa de 384 pocillos de fondo plano y lados negros y examinar bajo un microscopio de fluorescencia para evaluar las células vivas. Las células muertas no retendrán la tinción nuclear.

>5. Cribado de alto rendimiento (HTS) de moléculas pequeñas

1. Prepare una suspensión celular a 2 x 10⁶ células/mL de las células T activadas (perlas magnéticas o anticuerpos/CD40L) o grupos no activados.
2. Placa de 75.000 células/pocillo en una placa de 384 pocillos (volumen de 40 μL). Utilice una placa de 384 pocillos de fondo plano y lados negros o un portaobjetos de cubierta de microscopio para la evaluación de la viabilidad y la activación mediante microscopía fluorescente (paso de control de calidad opcional antes de HTS) utilizando la tinción de Hoechst (consulte los pasos 4.8 para obtener más detalles).
3. Manualmente o mediante un sistema automatizado, añada los fármacos de elección (disulfuro de dimetilo al 0,5%, DMSO) a cada pocillo.
4. Agregue el vehículo (DMSO) a los pozos de control positivos (activados) y negativos (no activados). Ajuste la concentración de DMSO a un máximo de 0,5%.
5. Incubar las placas durante 24 h (o tiempo de incubación a elección) a 37 ºC y 5% de dióxido de carbono, CO₂.
6. El día de la cribado, diluya la solución de tinción Hoechst 33342 (1:3.333; por ejemplo, añada 10 μL a las células de las placas de 384 pocillos para generar un volumen total de 50 μL). Teñir 30 min antes del análisis de GFP añadiendo la solución de Hoechst para lograr una concentración de 0,2 μg/mL.
7. Pipetear suavemente las células hacia arriba y hacia abajo para obtener una distribución homogénea en cada pocillo.
   nota: Este paso es importante en el caso de la dispensación de los medicamentos (paso 5.3) utilizando un sistema automatizado ya que las células tienden a acumularse en un lado del pocillo, en sentido opuesto a la dirección del flujo.
8. Girar los platos a 45 x g durante 3 min a temperatura ambiente.
9. Deje reposar los platos durante 15 minutos a temperatura ambiente.
10. Realice la lectura de la(s) placa(s), utilizando el sistema automatizado de cribado confocal de alto contenido (HCS). Cargue la placa en la máquina. Ajuste el objetivo a un aumento de 40X o superior. Utilice la cámara #4 para Hoechst (lámpara UV) y la cámara #1 para GFP (láser 488). Configure la máquina para leer de 6 a 10 campos por pozo. Ajuste la máquina para realizar dos lecturas secuenciales por campo a 488 nm (para leer GFP) y luz UV (para leer Hoechst). Ajuste el objetivo a un aumento de 40X o superior.
    nota: El sistema es un microscopio computarizado que no requiere ningún ajuste. La distancia focal, la intensidad de la luz incidente y el tiempo de exposición son configurados automáticamente por la máquina.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ratones Nur77GFP	El Laboratorio Jackson	Cepa de ratón n.º 016617	Se estableció una colonia interna en nuestro animalario
Placas de cultivo de 96 pocillos-U, estériles	VWR Internacional	10062-902	Activación de células T mediante las perlas magnéticas
Filtro de células de 70 μm, estéril	Corning Inc.	352350	Generación de suspensión celular de esplenocitos
5 ml de tubos de poliestireno de fondo redondo, estériles	Corning Inc.	352058	Generación de suspensión celular de esplenocitos
50 ml de tubos de fondo cónico de polipropileno, estériles	VWR Internacional	89039-656	Generación de suspensión celular de esplenocitos
Jeringa de 10 ml sin aguja, estéril	Becton, Dickinson y compañía	305482	Para machacar el bazo
Plato de cultivo celular de 5 ml, estéril	Greiner Bio-One	627 160	Para machacar el bazo
Penicilina-estreptomicina (10.000 u/mL)	WISENT Inc.	450-200-EL	Componente de la media del esplenocito
RPMI 1600 con bicarbonato de sodio y L-glutamina	WISENT Inc.	350-002-CL	Componente de la media del esplenocito
Aminoácidos no esenciales MEM	WISENT Inc.	321-010-EL	Componente de la media del esplenocito
Ácido libre HEPES 1 M	WISENT Inc.	330-050-EL	Componente de la media del esplenocito
Solución de piruvato de sodio (100 mM)	WISENT Inc.	600-110-EL	Componente de la media del esplenocito
Suero fetal bovino (FBS)	WISENT Inc.	080-910	Componente del medio esplenocitario y tampón de citometría de flujo
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	WISENT Inc.	311-010-CL	Componente del tampón de citometría de flujo
2-Mercaptoetanol (55mM)	Thermo Fisher Scientific	21985-023	Componente de la media del esplenocito
Kit de aislamiento de células T	Tecnologías de células madre	Año 19851	Para aislar las células T
Ratón T-Activator CD3/CD28 perlas superparamagnéticas	Thermo Fisher Scientific	11452D	Para activar las células T
Imán de aislamiento de celdas	Tecnologías de células madre	Año 18000	Para aislar las células T y eliminar las perlas magnéticas
IL-7 murina recombinante	Peprotech	Artículo 217-17	Para favorecer la supervivencia de las células T durante la activación
Anticuerpo CD3 anti-ratón	BD Pharmingen	561799	Para teñir células T para citometría de flujo
Biomed FXp	PerkinElmer Inc.	A31842	Para volver a suspender las células después de 24 horas de incubación
Sistema de cribado de alto contenido Opera Phenix	PerkinElmer Inc.	HH14000000	Para analizar la señal GFP/Hoechst