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Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.
1. Configuración del instrumento
NOTA: La obtención de imágenes de células levitantes requiere que se coloquen dos imanes de neodimio de tierras raras magnetizados en el eje z con el mismo polo uno frente al otro para generar un campo magnético. La distancia entre los imanes se puede personalizar en función de la intensidad del campo magnético y la densidad de los objetivos. En este caso, los imanes están separados por un espacio de 1 mm, suficiente para la inserción de un tubo capilar de vidrio cuadrado de 1x1 mm de 50 mm de largo. El dispositivo se imprimió en 3D utilizando un diseño de AutoCAD, que está disponible bajo pedido.
- Coloque el microscopio de lado, perfectamente horizontal.
nota: Un microscopio colocado en una posición vertical estándar no es directamente adecuado para obtener imágenes de objetos que levitan debido a las posiciones de los imanes con respecto al condensador y al objetivo. Esta limitación se puede eludir colocando el microscopio de lado, perfectamente horizontal, lo que permite que el condensador enfoque la luz en el capilar y que la lente del objetivo obtenga imágenes de la célula que levita entre los imanes, manteniendo los requisitos de iluminación de Köhler.
- Apoye y nivele el soporte sobre una mesa de protoboard con 2 o 3 gatos de laboratorio.
- Para limitar las vibraciones, apoye la mesa de protoboard con pies amortiguadores de goma.
- Retire la platina y sustitúyala por un conector de laboratorio compacto para ajustar la altura del dispositivo de levitación (eje y) y dos etapas de traslación de un solo eje; una para ajustar el enfoque (eje z) y la segunda para escanear el tubo capilar.
- Conecte el dispositivo de levitación magnética a la toma de laboratorio mediante dos postes ópticos de miniserie.
>2. Unión de anticuerpos a carboxi-micropartículas/perlas (Modificado de un protocolo por PolyAn)
NOTA: Solo las perlas de baja densidad (1,05 g/mL) necesitan ser recubiertas para la detección de Rhesus, Rh(+), pero tanto las perlas de alta como las de baja densidad están recubiertas para la detección de vesículas extracelulares.
- Extraer el equivalente a 1 mg de suspensión de perlas y añadir 0,5 mL de tampón de activación (50 mM de ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico, MES (MW195,2, 9,72 mg en 1 mL)) pH 5,0 y 0,001% de polisorbato-20).
- Añadir 12 μL de clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) 1,5 M recién hecho (MW 191,7, 0,28755 g en 1 mL) y 12 μL de Sulfo-N-Hidroxisuccinimida (NHS) 0,3 M (MW 217,14, 0,0651 g en 1 mL) en agua helada.
- Coloque los tubos en un agitador orbital y agite vigorosamente durante 1 h a temperatura ambiente para activar los grupos carboxilo en las perlas.
- Detenga la activación después de 1 h agregando 0,5 mL de tampón de acoplamiento (solución salina tamponada con fosfato 10x, PBS, o fosfato 0,1 M pH 7-9).
- Granule las perlas centrifugando a 20.000 x g durante 10 min o, si las perlas no se pueden peletizar, utilice un filtro de tubo de centrífuga de 0,45 μm. Aspirar el sobrenadante o de flujo.
- Lave las perlas con 1 mL de PBS 10x 3 veces como en el paso 2.5.
- Calcule 25 μg de anticuerpo por mg de perlas y mezcle el anticuerpo deseado con perlas activadas hasta una concentración final de anticuerpo de 0,7-1,0 mg/mL en 10X PBS.
- Coloque los tubos en un balancín de tubos ajustado a baja velocidad. Enrolle los tubos suavemente a temperatura ambiente durante la noche para acoplarlos.
- Repita el paso 2.5 y lave las perlas dos veces con 1 ml de 10x PBS.
- Lavar con 0,5 mL de etanolamina 1 M (98% de stock = 16,2 M) en tampón pH 8,0 con 0,02% de polisorbato-20 durante 1 h a temperatura ambiente mientras se agita suavemente.
- Repita el paso 2.5 y lave las perlas una vez en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco. Las perlas se pueden almacenar en 200 μL de DPBS a 4 °C hasta que se necesiten.
nota: El protocolo se puede pausar aquí.
>3. Recolección y preparación de sangre para la detección de Rh(+)
- Con un dispositivo de punción de un solo clic, pinche el dedo de un donante Rh(+) y extraiga 10 μL de sangre en 1 mL de DPBS.
- Teñir las células Rh+ con una tinción fluorescente de membrana plasmática. Opcionalmente, agregue 1 μL de colorante fluorescente a la suspensión de 1 mL de células Rh+ (dilución 1:1000).
- Incubar las células con el colorante fluorescente a 37 °C durante 15 min.
- Granular las células girando a 5.600 x g durante 15 s y lavar 3 veces con 1 mL de DPBS. Vuelva a suspender en 1 ml de solución salina equilibrada (HBSS) de Hanks con calcio y magnesio (HBSS++).
- Con el dispositivo de punción de un clic, pinche el dedo de un donante Rh(-) y extraiga 2 μL de sangre.
nota: Si prepara más de 2 afecciones, recoja suficiente sangre para agregar 1 μL de sangre Rh(-) a cada tubo.
- Preparar los tubos experimentales necesarios: Perlas solas, control de inmunoglobulina G (IgG), muestra.
- Perlas solas: añadir 174 μL de HBSS++, 1 μL de perlas de control de IgG, 1 μL de perlas de alta densidad (1,2 g/mL) y 24 μL de 500 mM Gd3+ (60 mM).
- Control de IgG: añadir 172 μL de HBSS++, 1 μL de gránulos de control de IgG, 1 μL de gránulos de alta densidad, 1 μL de sangre Rh-, 1 μL de suspensión sanguínea Rh+ teñida y 24 μL de 500 mM Gd3+.
- El tubo de muestra agrega 172 μL de HBSS++, 1 μL de perlas recubiertas anti-RhD, 1 μL de perlas de alta densidad, 1 μL de sangre Rh-, 1 μL de suspensión sanguínea Rh(+) teñida y 24 μL de 500 mM Gd3+.
nota: Las perlas de alta densidad se agregan a las muestras de Rh como referencia.
>4. Análisis de células en el dispositivo de levitación magnética
- Realice el arranque del instrumento de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Cargue 50 μL de muestra en un tubo capilar hasta que el tubo esté lleno. Selle los extremos del tubo capilar con sellador capilar asegurándose de que no haya burbujas de aire.
- Cargue el tubo capilar en el soporte entre los imanes superior e inferior. Ajuste el escenario y el enfoque para una visualización óptima.
nota: Las células/perlas pueden tardar entre 5 y 20 minutos en alcanzar su posición de equilibrio magnético en función de su densidad y la concentración de Gd3+. Cuanto mayor sea la concentración de Gd3+, menor será el tiempo.