Una técnica in vitro para estudiar la interacción de las células T con bicapas lipídicas planas soportadas

Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.

>1. Aislamiento de linfocitos T CD4⁺ para un análisis de imagen

1. Descongele una alícuota de 1 ml que contenga 10⁷ células mononucleares de sangre periférica (PBMC) congeladas o células mononucleares de ganglios linfáticos (LNMC) de muestras recolectadas. En una campana estéril, agregue las células descongeladas a 9 mL de RPMI suplementado con penicilina/estreptomicina y glutamina.
   1. Centrifugar las células durante 10 min a 300 x g a 4 °C, aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 5 mL de RPMI suplementado que contenga un 10% de FBS (medio completo). Incubar las células durante la noche en una incubadora de CO₂ a 37 °C.
2. Al día siguiente, purifique las células T CD4⁺ mediante clasificación inmunomagnética negativa utilizando un kit disponible en el mercado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
3. Para medir el número de linfocitos T CD4⁺ recién purificados, mezcle 5 μL de la suspensión celular con un volumen igual de una solución de azul de tripano. Cargue un hemocitómetro con una mezcla de celda y azul de tripano y cuente las células vivas dentro de las 5 secciones del hemocitómetro.
4. Tome el promedio del número de células y determine el número de células en la suspensión celular original: el número de células/1 mL = el recuento promedio x 2 x 10⁴. Si el número total de celdas aisladas es demasiado pequeño, use las celdas tal cual sin contar.
5. Centrifugar las células a 300 x g durante 10 min y resuspenderlas en un tampón de ensayo (20 mM de HEPES, pH 7,4, 137 mM de NaCl, 2 mM de Na2 HPO₄, 5 mM de D-glucosa, 5 mM de KCl, 1 mM de MgCl₂, 2 mM de CaCl₂ y 1% de albúmina sérica humana) a 10⁵ células/50 μL o menos y mantener las células a 4 °C (durante 1-2 h) hasta que estén listas para uso en los experimentos.
6. Desechar todos los residuos biológicos de acuerdo con las directrices institucionales pertinentes.
7. Si lo desea como población de células de control, prepare linfocitos T CD8⁺ activados a partir de PBMC de sangre de cordón umbilical, coloque 10⁷ células en 5 mL de medio completo en un matraz de cultivo T25 cubierto con una mezcla de anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 a 10 μg/mL y 1 μg/mL, respectivamente.
8. Al día siguiente, retire las células de la sangre del cordón umbilical activadas del matraz, lávelas 1 vez con medio completo fresco y expanda las células en presencia de IL-2 recombinante (100 U/mL) durante 2 semanas.
9. Purifique las células T CD8⁺ de la sangre del cordón umbilical mediante clasificación inmunomagnética negativa utilizando el kit disponible en el mercado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cuente las células e intercambie el medio con el tampón de ensayo como se describe en los pasos 1.3-1.6 para las células T LN y PB CD8⁺.

>2. Componentes para la preparación de las bicapas lipídicas planas

1. Prepare 3 tipos de liposomas como se describe en otra parte: (a) liposomas DOPC (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina) de 0,4 mM, (b) liposomas DOPC de 0,4 mM que contienen 33 % molar de DOGS-NTA (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-[(N-(5-amino-1-carboxipentil)ácido iminodiacético)succinil] (sal de amonio)) lípidos, (c) liposomas DOPC de 0,4 mM que contienen 4 mol% de Biotinil-Cap-PE (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(tapa biotina) (sal de sodio)).
2. Prepare la solución de caseína al 5% como se describió anteriormente.
   1. Disolver 5 g de caseína en polvo en 100 mL de agua ultrapura y añadir 350 μL de hidróxido de sodio 10 M. Agitar todo en un agitador magnético normal a una velocidad lenta según la escala disponible, a temperatura ambiente durante 2 h, y luego durante la noche a 4 °C. Ajustar el pH a 7,3 y ultracentrifugar la solución durante 2 h a 100.000 x g a 4 °C. Filtrar el sobrenadante con un filtro estéril de 0,22 μm y almacenar la solución en alícuotas a -80 °C.
      cautela: La solución de hidróxido de sodio puede causar quemaduras químicas y puede inducir ceguera permanente al contacto con los ojos. Use guantes de goma, ropa de seguridad y protección para los ojos cuando manipule este producto químico o sus soluciones.
3. Marcar anticuerpos anti-CD3 con biotina para producir moléculas de anticuerpos monobiotinilados con un enfoque descrito anteriormente.
   1. Prepare una solución de biotina-PEO4-NHS en dimetilsulfóxido (DMSO) a 0,1 mg/mL. Añadir 3,7 μL de la solución de biotina-PEO4-NHS a 1 mg de anticuerpo en 0,5 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenga 100 mM de bicarbonato sódico.
   2. Incubar la mezcla durante 2 h a temperatura ambiente. Prepare una solución de éster Alexa Fluor 488 NHS a 10 mg/mL en DMSO. Agregue la solución de éster Alexa Fluor 488 NHS al anticuerpo marcado por Biotin-PEO4-NHS con un exceso molar de 10 veces.
   3. Incubar la mezcla durante 1 h a temperatura ambiente agitando lentamente en un agitador magnético normal. Separe el tinte no unido mediante cromatografía de exclusión por tamaño.
   4. Determine la concentración de anticuerpos midiendo la densidad óptica de la solución de anticuerpos a 280 nm (A280). Mida la densidad óptica de los anticuerpos marcados a 577 nm (A577).
   5. Determine la relación colorante-anticuerpo usando la siguiente ecuación:
      
      nota: Encuentre detalles adicionales en el protocolo del fabricante.
4. Expresar una proteína soluble recombinante de la molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1) en un sistema de expresión de Drosophila como se describió anteriormente.
   1. Clonar, con codificación de ADNc, el ectodominio de ICAM-1 en el vector de expresión de Drosophila pMT/V5-His con un promotor de metalotioneína inducible para producir una proteína recombinante anexada con una etiqueta His6 en el extremo C-terminal.
   2. Co-transfectar células S2 con el plásmido que contiene ICAM-1 resultante y un vector de expresión de genética (G418). Seleccione transfectantes estables utilizando Drosophila Media de Schneider suplementado con un 10% de suero fetal de ternero (FCS) y 0,5 mg/mL de G418 durante 3 semanas. Expanda las células en medio de insectos libre de suero e induzca una expresión de proteínas con 0,5 mM CuSO₄ durante 3 días.
   3. Concentrar el sobrenadante de cultivo 10x y dializar contra PBS a través de un concentrador de flujo tangencial como se describió anteriormente.
   4. Aplique el sobrenadante de cultivo concentrado a una columna que contenga Sepharose con un anticuerpo monoclonal anti-ICAM-1 inmovilizado covalentemente y eluya el ICAM-1 unido con un tampón de glicina de 50 mM, pH 3,0. Neutralizar inmediatamente la proteína ICAM-1 eluida con un tampón Tris de 2 M, pH 8,0.
   5. Diálisar el material eluido contra PBS, pH 8.0, y agregar el material dializado a una columna que contenga nia-NTA (ácido níquel-nitriloacético) agarosa. Eluto soluble ICAM-1 con 200 mM de imidazol, pH 8,0. Diálisar el material eluido contra un tampón PBS, pH 8.0.
   6. Etiquete el ICAM-1 purificado con éster de nianina 5 N-hidroxisuccinimida (Cy5 NHS) de acuerdo con las instrucciones del fabricante><. nota: La mejor proporción final de colorante a proteína es de 1:1.
5. Producir fragmentos de Fab a partir de un anticuerpo anti-CD107a mediante digestión con papaína y purificar los fragmentos de Fab mediante cromatografía de intercambio iónico como se ha descrito anteriormente. Etiquete los fragmentos Fab con el éster Alexa Fluor 568 NHS de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

>3. Formación de bicapas lipídicas planas soportadas por vidrio

1. Prepare una solución fresca de piraña ácida mezclando 140 mL de ácido sulfúrico concentrado y 60 mL de peróxido de hidrógeno al 30%. Lave los cubreobjetos de vidrio para los portaobjetos de flujo sumergiéndolos en la solución ácida de piraña durante 30 min. Sujete el cubreobjetos de vidrio con pinzas de polipropileno tipo tijera.
   cautela: La solución de piraña es un oxidante extremadamente fuerte. Recuerde usar anteojos o gafas de seguridad o un protector facial completo junto con guantes de goma gruesos en todo momento mientras manipula la solución. Solo trabaje con solución de piraña debajo de una campana extractora. Evite calentarlo, transportarlo o sacudirlo en cualquier momento durante el uso, ya que puede explotar. Recoja los desechos de la piraña en una botella de vidrio con un orificio que contenga plomo. Contactar al Comité de Seguridad Institucional sobre el aprovechamiento adecuado de los residuos.
2. Enjuague los cubreobjetos lavados 7 veces con agua ultrapura transfiriéndolos secuencialmente a vasos de precipitados que contengan agua dulce. Deja los cubreobjetos húmedos a un lado para dejar que el agua restante se deslice del vaso limpio, dejando atrás el vaso seco.
   1. Alternativamente, use una punta de pipeta conectada a una bomba de vacío para eliminar con cuidado las gotas de agua restantes de los cubreobjetos.
3. En la campana estéril, realice diluciones de varios lípidos para producir la mezcla de liposomas para hacer bicapas. En primer lugar, combine 37 μL de liposomas DOPC y 3 μL de liposomas Biotinyl-Cap-PE. En segundo lugar, mezcle 14 μL de liposomas DOPC y 15 μL de liposomas DOGS-NTA. En tercer lugar, agregue 1 μL de la primera mezcla a 29 μL de la segunda mezcla para fabricar la mezcla final de liposomas.
4. En la campana estéril, establezca un espacio de trabajo con cubreobjetos secos cerca. Alícuota 2 μL de la mezcla final de liposomas (ver paso 3.3) precisamente en el centro de un canal de portaobjetos autoadhesivo. Alinee inmediatamente y con mucha precisión un cubreobjetos limpio y seco con la corredera y baje suavemente el cubreobjetos en el lado adhesivo de la corredera.
   1. Si prepara más de un portaobjetos, trabaje en un portaobjetos a la vez, ya que la mezcla de liposomas se evapora rápidamente. Dé la vuelta al portaobjetos y utilice el anillo exterior de pinzas de polipropileno tipo tijera para aplicar una presión suave en el contacto periférico del cubreobjetos con el portaobjetos, asegurándose de que el portaobjetos esté bien sujeto al portaobjetos para evitar fugas.
      nota: No presione contra los canales de la corredera para evitar romper o agrietar el cubreobjetos.
   2. Vuelva a girar la corredera y marque la posición de la bicapa formada, que parece una gota entre el cubreobjetos y la corredera del canal, dibujando 4 puntos con un marcador permanente alrededor de la bicapa en el lado de la corredera externa del conjunto.
5. Antes de la primera inyección de un líquido en el canal, designe un puerto del canal como puerto de entrada y el otro como puerto de salida y mantenga esta designación durante todo el experimento.
6. Para evitar la formación de burbujas, inserte el extremo de la punta de la pipeta directamente en el puerto de entrada del canal. Llene lentamente los canales del portaobjetos con 50 μL de tampón de ensayo tibio (al menos a temperatura ambiente) (consulte el paso 1.5 para ver la composición del tampón).
7. Prepare una solución de cloruro de níquel (II) 0,5 M. Descongelar una alícuota de 2 mL de solución de caseína en un baño de agua a 37 °C durante 30 min y plepinarla con una solución de cloruro de níquel a una concentración final de 200 μM.
8. Lave las bicapas inyectando primero 100 μL de la solución de caseína en el puerto de entrada del canal y luego retirando inmediatamente 100 μL del puerto de salida del portaobjetos mediante pipeteo. Bloquee las bicapas con la misma solución inyectando 100 μL de la solución de caseína en el puerto de entrada de cada canal e incubando el portaobjetos durante 45 minutos a temperatura ambiente.
9. Descongela las alícuotas de las proteínas Cy5-ICAM-1-His₆ y estreptavidina. Combine las proteínas en el tampón de ensayo a la concentración final de 2 μg/mL cada una. Centrifugar la solución durante 30 min a 20.000 x g y 4 °C para eliminar los agregados.
10. Retire el resto de la solución de bloqueo del puerto de salida del canal de deslizamiento mediante pipeteo. Inyecte 100 μL de la solución que contiene ICAM-1 y estreptavidina en el puerto de entrada.
11. Incubar el portaobjetos durante 45 minutos a temperatura ambiente. Retire cualquier exceso de la solución de proteínas del puerto de salida. Lave la bicapa 2 veces inyectando primero 100 μL del tampón de ensayo en el puerto de entrada del canal y luego retirando inmediatamente 100 μL del puerto de salida.
12. Diluya un anticuerpo anti-CD3 marcado con Alexa-Fluor-488 con el tampón de ensayo hasta una concentración final de 2 μg/mL. Inyecte 100 μL de la solución de anticuerpos en el puerto de entrada del portaobjetos e incube durante 45 minutos a temperatura ambiente. Retire cualquier exceso de la solución de proteínas del puerto de salida. Lave la bicapa 2 veces con 100 μL del tampón de ensayo como en el paso 3.11.

>4. Imagen de la interacción de las células T con la bicapa plana

1. Precaliente la platina y el objetivo de un microscopio confocal o de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) hasta que la temperatura esté equilibrada a 37 °C. Coloque el portaobjetos con la(s) bicapa(s) en la platina calentada. Mueva la platina a una posición adecuada de acuerdo con las marcas de tinta y concéntrese en la bicapa que emplea fluorescencia de moléculas ICAM-1 marcadas con Cy.
   1. Utilice un objetivo de 61X para el microscopio confocal, o un objetivo de 100X para el microscopio TIRF, con los ajustes de filtro adecuados.
2. Para obtener imágenes de liberación de gránulos mediante microscopía TIRF, agregue fragmentos Fab del anticuerpo anti-CD107a marcados con Alexa-Fluor-568 a la suspensión celular a una concentración final de 4 μg/mL antes de inyectar las células en los puertos de entrada.
   1. Vuelva a suspender las células T CD4⁺ preparadas aisladas de LN, PB o sangre del cordón umbilical e inyecte 50 μL de la suspensión celular en el puerto de entrada del canal portaobjetos que contiene la bicapa.
3. Elija el número deseado de campos y grabe imágenes de cada campo 1 vez cada 2 minutos durante 30 minutos después de la inyección.
4. Aproveche el campo claro, la luz reflejada y los canales fluorescentes (Alexa 488 y Cy5) del microscopio confocal para adquirir las imágenes. Utilice el modo TIRF para la fluorescencia de Alexa-Fluor-488 y Alexa-Fluor-568 y el campo amplio para la fluorescencia Cy5, así como la obtención de imágenes de campo claro, en el microscopio TIRF.