Efecto de un agente farmacológico inmunomodulador en la interacción entre células dendríticas y linfocitos T CD4+

Resumen

Fuente: Wei, H., et al. Desarrollo y caracterización funcional de células dendríticas tolerogénicas murinas. J. Vis. Exp. (135), (2018).

Este video muestra un método de conversión de células dendríticas (CD) en CD tolerogénicas (TolDC) utilizando un agente farmacológico inmunomodulador. Esta conversión se confirma mediante la evaluación de la función de TolDC a través de su efecto inmunosupresor sobre las células T CD4+.

Protocolo

1. Evaluar la función de los TolDCs in vitro e in vivo

1. Ensayo de proliferación singénica de células T
   1. Esterilizar todo el instrumental quirúrgico mediante autoclave y realizar el experimento en una cabina de seguridad biológica de clase II con los procedimientos de seguridad adecuados.
   2. Prepare el tampón MACS utilizando albúmina sérica bovina (BSA) al 0,5% y 2 mM de EDTA en 500 ml de PBS. Esterilizar el tampón filtrando a través de un filtro de 0,2 μm.
      nota: Mantenga el tampón en el hielo durante el siguiente experimento.
   3. Para obtener linfocitos T CD4+, se practica la eutanasia a ratones transgénicos con receptor de linfocitos T (TCR) OT-II de 8 a 10 semanas de edad mediante el uso de una cámara de CO₂. Coloque el ratón en una tabla de disección y enjuague con etanol al 70%. Aísle el bazo del lado izquierdo del abdomen con tijeras quirúrgicas y fórceps.
   4. Coloque el bazo con 2 ml de PBS en una placa de cultivo de 6 cm y utilice el dorso de la varilla de una jeringa de 3 ml para picar el bazo pasando un colador de células de 40 μm.
   5. Recoja la suspensión de la célula y la centrífuga a 300 x g durante 5 minutos.
   6. Vuelva a suspender el pellet de celda en 400 μl de tampón MACS.
   7. Añadir 100 μl de cóctel de biotina-anticuerpo de células T CD4+ a 4 °C durante 5 minutos><. nota: El cóctel de anticuerpos se une a otros tipos de células, excepto a las células T CD4+, como CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, Anti-MHC clase II, Ter-119 y TCRγ/δ.
   8. Añadir 300 μl de tampón MACS y 200 μl de perlas anti-biotina (Tabla de Materiales) a 4°C durante 10 minutos.
   9. Coloque la columna compuesta por esferas ferromagnéticas (Tabla de Materiales) y Filtro de Pre-Separación juntos en el campo magnético y enjuague con 3 ml de tampón MACS.
   10. Añadir 9 ml de tampón MACS en las células y centrifugar a 300 x g durante 5 minutos.
   11. Vuelva a suspender el pellet de celda en 3 ml de tampón MACS y aplíquelo a la columna. Recoja el flujo que contiene células T CD4+.
   12. Lave la columna con otros 3 ml de tampón MACS y recoja también el flujo.
   13. Para obtener DC de pan esplénico, se sacrifica a los ratones C57BL/6 de 8 a 10 semanas de edad mediante el uso de una cámara de CO₂. Coloque el ratón en una tabla de disección y enjuague con etanol al 70%. Aísle el bazo del lado izquierdo del abdomen con tijeras quirúrgicas y fórceps. Coloque el bazo en una placa de cultivo de 6 cm que contenga 2 ml de solución de colagenasa D (2 mg/ml de colagenasa D disuelta en HBSS que contenga calcio y magnesio).
   14. Inyecte 1 ml de solución de colagenasa D en el bazo dos veces con una jeringa de 1 ml y una aguja de 25 G. Corta el bazo en trozos pequeños con unas tijeras pequeñas.
   15. Agitar e incubar a temperatura ambiente durante 25 minutos.
   16. Añadir 500 μl de EDTA 0,5 M a temperatura ambiente durante 5 minutos.
       nota: Los pasos de 1.1.13-1.1.14 son críticos para aumentar el rendimiento de los DC.
   17. A continuación, utilice el dorso de la varilla de la jeringa de 3 ml para picar la suspensión del bazo pasando un colador de células de 40 μm y recoja la suspensión de células centrifugando a 300 x g durante 5 minutos.
   18. Vuelva a suspender el pellet celular en 350 μl de tampón MACS, 50 μl de reactivo bloqueante FcR y 100 μl de cóctel de biotina-anticuerpo de células pandendríticas a 4 °C durante 10 minutos.
       nota: El cóctel de anticuerpos contra antígenos que no son expresados por las CD.
   19. Lave las células añadiendo 9 ml de tampón MACS y centrifugue a 300 x g durante 5 minutos.
   20. Vuelva a suspender el pellet celular en 800 μl de tampón MACS y agregue 200 μl de perlas Anti-Biotina a 4 °C durante 10 minutos.
   21. Repita los pasos de 1.1.9 a 1.1.11 para recopilar controladores de dominio.
   22. Lave la columna con otros 3 ml de tampón MACS dos veces y recoja también el flujo de paso.
   23. Trate los 2 x 10⁵ DCs/ml en presencia o ausencia de CDDO-DFPA de 100-400 nM a 37 °C durante 1 hora. Por separado, etiquete los linfocitos T CD4+ (1 x 10⁷/ml) con 1 μM CFSE a 37 °C durante 15 minutos, lave con PBS y reajuste el volumen para obtener la concentración final a 2 x 10⁶ linfocitos T/ml.
   24. A continuación, en una placa de 96 pocillos, se cocultivaron 100 μl de las células dendríticas tratadas con el mismo volumen de células T CD4+ marcadas con CFSE, ambas recogidas en los pasos anteriores para obtener una proporción de 1:10. Ahora agregue 100 ng/mL del péptido 323-329 de ovoalbúmina (OVA) por pocillo y mida la intensidad de CFSE de las células T mediante citometría de flujo después de 2-3 días de incubación
       nota: El número de células y la proporción de células DC y T se han optimizado a partir de nuestro trabajo anterior.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
CDDO-DFPA (RTA-408)	Reata Pharmaceuticals	Síntesis interna	cultivo celular
Ratón GM-CSF	Peprotech Inc	315-03	Diferenciación BMDC
Kit de aislamiento de células pandendríticas	Miltenyi Biotec Inc.	Llame al 130-100-875	Ensayo de proliferación de linfocitos T
Cóctel pandendrítico de biotina-anticuerpo	Miltenyi Biotec Inc.	Llame al 130-100-875	Ensayo de proliferación de linfocitos T
Kit de aislamiento de células T CD4+	Miltenyi Biotec Inc	130-104-454	Ensayo de proliferación de linfocitos T
CFSE (en inglés)	BioLeyenda	423801	Ensayo de proliferación de linfocitos T
Reactivo de bloqueo FcR	Miltenyi Biotec Inc.	Llame al 130-100-875	Ensayo de proliferación de linfocitos T
Microperlas anti-biotina	Miltenyi Biotec Inc.	130-104-454	Ensayo de proliferación de linfocitos T
Jeringa de 1 ml	BD Biociencias	309626	Ensayo de proliferación de linfocitos T
Bsa	Sigma Aldrich Inc	A2058	Ensayo de proliferación de linfocitos T
EDTA	ThermoFisher Scientific	15575020	Ensayo de proliferación de linfocitos T
Columna LS	Miltenyi Biotec Inc.	130-042-401	Ensayo de proliferación de linfocitos T
Filtro de pre-separación	Miltenyi Biotec Inc	130-095-823	Ensayo de proliferación de linfocitos T
Colagenasa D	Sigma Aldrich Inc.	11088858001	Ensayo de proliferación de linfocitos T
HBSS	ThermoFisher Scientific	14025076	Ensayo de proliferación de linfocitos T
Péptido de ovoalbúmina (OVA) 323–329	Sigma Aldrich Inc.	O1641	Ensayo de proliferación de linfocitos T