Una técnica in vitro para visualizar la exocitosis de los gránulos secretores en los mastocitos

Resumen

Fuente: Klein, O., et al. Imaging FITC-dextrano como indicador de exocitosis regulada J. vis. Exp. (2018).

Este video muestra una técnica para visualizar la exocitosis en mastocitos. Las células se incuban con FITC-dextrano, un reportero fluorescente, que es absorbido por las células dentro de los gránulos secretores (SG), donde el pH ácido apaga su fluorescencia. Tras la estimulación de la exocitosis de gránulos, el pH más alto del medio induce fluorescencia reportera dentro de los SG fusionados, que se visualiza utilizando un microscopio de fluorescencia.

Protocolo

1. Preparativos

1. Preparación de medios de cultivo RBL (línea de mastocitos RBL-2H3)
   1. Mezclar 500 mL de medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) bajo en glucosa con 56 mL de suero fetal bovino (FBS), 5,5 mL de solución de penicilina-estreptomicina-nistatina, 5,5 mL de solución de L-Glutamina 200 mM. Esto da como resultado DMEM bajo en glucosa suplementado con 10% de FBS, 100 μg/mL de estreptomicina, 100 unidades/mL de penicilina, 12 unidades/mL de nistatina y 2 mM de L-glutamina.
   2. Filtre el medio con un filtro de vacío superior de 0,22 μm de tamaño de poro y guárdelo a 4 °C.
2. Mantenimiento de las células RBL.
   1. Cultive células RBL hasta una confluencia máxima del 90% en un plato de 10 cm. Si el cultivo celular está sano, las células deben tener una forma de huso con protuberancias ocasionales.
   2. Para la división de las células, separe las células de la placa aspirando el medio y sustituyéndolo por 2 mL de solución B de tripsina/EDTA. Incubar durante 5-10 minutos en una atmósfera humidificada de 5% de CO₂ a 37 °C.
   3. Una vez que las células se hayan desprendido, neutralice la tripsina añadiendo 2 mL de medio de cultivo, utilizando una pipeta, y divida las células en una proporción de 1:2 a 1:10.
3. Preparación de 20x Tampón de Tyrode
   1. Prepare una solución stock 20x de 54 mM de KCl, 20 mM de MgCl₂, 2,74 M de NaCl y 8 mM de NaH₂PO₄ en agua bidestilada (DDW). Mezclar bien y conservar a 4 °C.

2. Cultivo de células RBL para microscopía de células vivas

1. Preparación de la solución de FITC-dextrano.
   1. Mezclar 1 mg de polvo de isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano (150 K) por 1 ml de medio de cultivo (ver paso 1.1.1). Para un cubreobjetos de cámara completa, prepare 3 mL.
   2. Utilizando una unidad de filtro de jeringa de acetato de celulosa con un tamaño de poro de 0,22 μm, filtre el FITC-dextrano disuelto.
   3. Añadir inmunoglobulina E (IgE) de ratón hasta una concentración de 1 μg/mL.
2. Siembra de células RBL para la obtención de imágenes
   1. El día antes de la toma de imágenes, aspire el medio de la placa de cultivo y reemplácelo con 2 mL de solución B de tripsina/ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Incubar durante 5 a 10 minutos en una atmósfera humidificada de 5% de CO₂ a 37 °C. Una vez que las células se hayan desprendido, neutralice la tripsina añadiendo 2 mL de medio de cultivo.
   2. Cuente las células RBL con un hemocitómetro y ajuste el volumen en consecuencia con los medios de cultivo para obtener una concentración celular de 7,5 x 10⁵/mL.
   3. Añada 10 μL de la suspensión celular a un cubreobjetos con cámara precargado con medios de cultivo frescos suplementados con FITC-dextrano (esto da como resultado la siembra de^7,5 x 10 3 células en una cámara).
   4. Cultive células RBL durante la noche en una atmósfera humificada de 5% de CO₂ a 37 °C. Las células deben permanecer a un nivel subconfluente para asegurarse de que las células estén separadas y que sea fácil identificar cada célula individualmente bajo el microscopio.
3. Transfección de células RBL - opcional.
   1. Para obtener imágenes de eventos exocíticos en combinación con otras proteínas marcadas con fluorescencia, consulte el protocolo de transfección para células RBL en Azouz et al.

3. Microscopía de células vivas de exocitosis

1. Preparación de soluciones:
   1. Prepare una solución tampón final de Tyrode diluyendo la solución madre en DDW en una dilución 1:20 y complemente con 20 mM de Hepes pH 7, 1,8 mM de CaCl₂, 1 mg/mL de albúmina sérica bovina (BSA) y 5,6 mM de glucosa.
   2. Preparar un reactivo de secretagogo 20x en tampón Tyrode [1 μg/mL de dinitrofenilo conjugado con albúmina sérica humana (DNP-HAS (Ag)) en nuestro caso, para una concentración de 50 ng/mL 1x].
   3. Prepare una solución de cloruro de amonio de 400 mM disolviendo el polvo en el tampón de Tyrode.
2. Preparación de las células.
   1. Lave el cubreobjetos con cámara 3 veces aspirando el medio de la cámara y rellenándolo con 300 μL de tampón Tyrode, precalentado a 37 °C. Por último, reponga la cámara con 300 μL de tampón Tyrode, precalentado a 37 °C.
   2. Coloque el cubreobjetos con cámara en la cámara de la incubadora del microscopio. Asegúrese de que la cámara esté estable.
3. Configuración del microscopio
   1. Para elegir una región de interés para rastrear, encienda la fuente de luz fluorescente (tradicionalmente una lámpara de mercurio) y elija el filtro de fluorescencia adecuado (elija el filtro para fluoróforos verdes para ver FITC-dextrano). Una vez que la región de interés esté enfocada y esté en el centro del campo de visión, apague la fuente de luz para evitar el fotoblanqueo y la toxicidad><. NOTA: Parte del FITC-dextrano incorporado en las células puede retener fluorescencia. Esto se debe a que el FITC-dextrano también se puede clasificar en compartimentos no lisosomales, como los endosomas.
   2. Encienda la iluminación adecuada para la excitación FITC. Si utiliza un microscopio basado en láser, encienda el láser de 488 nm. La emisión debe recogerse alrededor de 500 - 550 nm (los picos de emisión FITC son de 510 a 520 nm).
   3. Cuando utilice un microscopio confocal, abra el orificio al máximo. Esto permitirá el uso de una menor potencia láser para evitar el blanqueo y la toxicidad y asegurará la captura de eventos de exocitosis de todos los planos de la célula.
   4. Calibrar el intervalo de tiempo entre las adquisiciones de imágenes.
      1. Las diferentes células pueden variar en su cinética de exocitosis regulada. Para obtener imágenes específicas de exocitosis compuesta, recomendamos un intervalo de tiempo de al menos 5 segundos. Sin embargo, como regla general, para permitir imágenes rápidas, asegúrese de que el tiempo de adquisición de un solo fotograma sea rápido.
      2. Cuando utilice un microscopio confocal de barrido láser, establezca la dirección de exploración en bidireccional, no permita el cálculo del promedio y establezca la resolución en 512 x 512 (recomendado; las dos últimas disposiciones también ayudarán a minimizar el blanqueo y la toxicidad).
4. Diagnóstico por imágenes de la exocitosis.
   1. Visualice las celdas durante los períodos deseados, según el tipo de célula o secretagogo. En las células RBL desencadenadas con IgE/Ag, la mayoría de los eventos exocíticos ocurren dentro de los 15 a 20 minutos posteriores a la activación.
   2. Para la activación de las células, agregue 16 μL de la solución secretagoga 20x a la cámara.
5. Confirmación de la presencia de FITC-dextrano en las células.
   1. Para confirmar la presencia y localización de FITC-dextrano en los SG, agregue 16 μL de solución de cloruro de amonio (tenga cuidado de no mover la cámara para no perder el enfoque) a la cámara suavemente (esto hará una concentración final de 20 mM). Esto inducirá la alcalinización de los SG y la extinción de la fluorescencia de FITC, que se producirá en cuestión de segundos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM glucosa baja	Inducciones biológicas	01-050-1A
Suero fetal bovino	Gibco	12657
Solución de pen-estreptococo-nistatina	Inducciones biológicas	03-032-1B
Solución de L-Glutamina 200 mM	Inducciones biológicas	03-020-1A
FITC dextrano 150K	Sigma-Aldrich	46946-500MG-F
Solución B de tripsina/EDTA	Inducciones biológicas	03-052-1A	Calentar en un baño de agua a 37 °C antes de usar
Filtro de vacío superior de 0,22 μm de tamaño de poro	Sigma-Aldrich	CLS430769-1EA
Unidad de filtro de jeringa de acetato de celulosa, tamaño de poro de 0,22 μm	sartorio	16534K
Cubreobjetos con cámara	Termo científico	155411
Placas de cultivo tratadas con cultivo de tejidos de Corning	Sigma-Aldrich	CLS430167
Albúmina sérica bovina	Sigma-Aldrich	A4503
IgE monoclonal anti-DNP	Sigma-Aldrich	D8406
DNP-HSA (Ag)	Sigma-Aldrich	A6661	Evite la exposición directa a la luz
Tampón Hepes 1M, pH 7.4	Inducciones biológicas	03-025-1B
CaCl2	Merk	102382
glucosa	Laboratorios BDH	284515V
Cloruro de amonio	Merk	Año 1145
PIPAS sal dipotásica	Sigma-Aldrich	108321-27-3
Hidrato de acetato de calcio	Sigma-Aldrich	114460-21-8
Acetato de magnesio tetrahidratado	Sigma-Aldrich	M5661
Glutamato de potasio (ácido L-glutámico, sal de potasio monohidratado)	Sigma-Aldrich	G1501
NaH2PO4	Merk	6346
NaCl	Merk	106404
MgCl2	Merk	105833
Kcl	Merk	104936
Electroporador	BTX	ECM830
Microscopio confocal, Zeiss	Zeiss	LSM 5 Pascal, Axiovert 200M	utilizado en la Figura 3. Equipado con un sistema electrónico de control de temperatura
incubadora Airstream
Microscopio confocal, Zeiss	Zeiss	LSM 800, Axio Observer.Z1 /7	utilizado en la Figura 2. Equipado con un detector de GaAsP y un sistema electrónico de control de temperatura
incubadora Airstream
Microscopio confocal, Leica	Leica	SP5	Se utiliza en la Figura 1. Equipado con un detector Leica HyD y una incubadora de etapa superior (okolab)
Células RBL-2H3			Las células RBL-2H3 se clonaron en el laboratorio de Reuben P. Siraganian. Ver referencia 67