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>1. Conjugación de antígeno proteico a lípidos pegilados
- Agregue 3 g de perlas de gel de dextrano reticulado con un rango de fraccionamiento de 1.500 a 30.000 Daltons (Da) a un matraz de vacío de 250 mL. Agregue 60 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y revuelva continuamente con una barra de agitación magnética. Selle el matraz y conéctelo a una aspiradora para iniciar la desgasificación en una placa de agitación durante un mínimo de 1 h.
- En una columna de cromatografía vítrea de 1,0 cm x 30 cm con el tapón de rotación cerrado, añada PBS a la columna a lavar. Abra el tapón de rotación y drene la columna. Después del lavado, agregue la lechada de perlas desgasificadas a la columna. Agregue continuamente la lechada hasta que la columna se compacte hasta una altura de cordón de aproximadamente 24 cm.
- Una vez que la columna tenga una "cabeza" de aproximadamente 4-5 cm de PBS por encima de las cuentas empaquetadas, tenga listos los siguientes pasos.
- Cree un sifón de flujo por gravedad midiendo un trozo de tubería lo suficientemente largo como para alcanzar un estante de 1 a 2 pies por encima de la parte superior de la columna y cree un bucle que caiga cerca de la parte inferior de la columna y regrese a la parte superior de la columna. Agregue un tapón de rotación a un extremo del tubo, dejando un lado del tubo abierto. Coloque el extremo del tubo abierto en una botella de 500 ml de PBS y colóquela en el estante sobre la columna.
- Tome el extremo con el tapón de rotación y coloque una jeringa de 10 mL. Abra la válvula de cierre de rotación en la línea de tubería y extraiga PBS a través del tubo. Una vez que el PBS haya alcanzado las tres cuartas partes del camino a través del tubo, retire rápidamente la jeringa y agregue el tapón de rotación a la parte superior de la columna: el líquido debe correr hacia la columna.
NOTA: La cantidad de "cabeza" de PBS que queda en la parte superior de la columna debe estar entre 1 y 3 cm. La cantidad mínima para lavar la columna es de 3 volúmenes de columna.
- Determine la cantidad de proteína (moles) que se unirá a los lípidos en función de su peso molecular (MW).
NOTA: El fragmento Fab de la inmunoglobulina anti-ratón de cabra, IgM (en sí misma una IgG) se utiliza aquí como antígeno sustituto universal para la estimulación policlonal de las células B. En consecuencia, el fragmento Fab de IgG de cabra tiene un MW de aproximadamente 48 kiloDalton (kDa) y está disponible comercialmente en una cantidad total de 1,3 mg. Por lo tanto, la cantidad de proteína a unir es de 27,1 μmol.
- Determinar el coeficiente de extinción de la proteína de interés. Si se desconoce, mida la absorbancia de la proteína a 280 nm utilizando un espectrofotómetro y divida el valor de A280 por el número de moles calculado en el paso 1.4.
NOTA: El coeficiente de extinción de Fab de cabra IgG a 280 nm es de 64.600 M-1.
- Para asegurarse de que se eliminan las trazas del tampón que contiene aminas, desala la proteína en la columna creada en los pasos 1.1-1.3 y recoja las fracciones de proteína en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml (~500 μl por fracción).
- Cierre la válvula de cierre de rotación conectada a la parte superior de la columna y retire la parte superior de la columna. Si aún no está abierta, abra la válvula de cierre de rotación en la parte inferior de la columna y espere hasta que la "cabeza" de PBS toque la parte superior de los cordones.
- Agregue lentamente la proteína de interés a la parte superior de las perlas con una pipeta Pasteur de vidrio, teniendo cuidado de minimizar la alteración de la parte superior de las perlas.
- Una vez que la "cabeza" de la solución proteica haya alcanzado la parte superior de las perlas, agregue 1 mL de PBS suavemente a través de una pipeta Pasteur. Repite tres veces. Agregue PBS para crear una cabeza de 4-5 cm y repita el paso 1.3 para lavar la columna.
NOTA: Este paso se puede omitir si se está seguro de que no hay ningún tampón que contenga aminas.
- Determine las fracciones que contienen proteína midiendo los valores de A280 y agrupe las fracciones que dan aproximadamente el 90% de recuperación de la proteína.
NOTA: Por lo general, esto diluye la proteína de 1,5 a 2 veces. Determine la concentración de proteínas después de la agrupación. Concentre la proteína en este paso, si es necesario, utilizando un concentrador de centrifugación.
- Agregue el equivalente de 2,5 molares del reticulante heterobifuncional a la proteína.
- En primer lugar, pese aproximadamente 5 mg de succinimidilo 3-(2-piriditio)propionato (SPDP, MW = 314 g/mol) en un tubo de microcentrífuga. Para determinar el volumen para disolver el SPDP, se debe multiplicar la concentración de proteína molar y 250x para generar una solución 100x que dará un exceso de 2.5 molares en la reacción.
NOTA: Por ejemplo, si la concentración de proteína es de 50 μM, se necesita una solución de SPDP a 12,5 mM. Para 5 mg de SPDP, esto corresponde a 1,27 mL de dimetilsulfóxido (DMSO).
- Agregue SPDP a la proteína de interés en una dilución de 1:100. Coloque la reacción en un agitador oscilante a temperatura ambiente (RT) durante aproximadamente 1 h.
- Para eliminar el exceso de SPDP y proteger los enlaces disulfuro endógenos en la proteína, en el paso de reducción posterior, equilibre y lave la columna creada en los pasos 1.1-1.3 en acetato de sodio (NaOAc) de 100 mM a pH 5.5 o cree una columna idéntica únicamente para su uso en este tampón.
- Después de 1 h de incubación con SPDP, desalar la proteína en la columna equilibrada en 100 mM de NaOAc. Lleve a cabo este paso de manera idéntica al paso 1.6, excepto que utilizando 100 mM de NaOAc (pH 5,5) como eluyente. Reúna las fracciones, determine el A280 y agrupe las fracciones superiores. Lave la columna en PBS.
- Preparar una solución de 2,5 M de DTT (MW = 154 g/mol) en agua bidestilada (ddH2O). Agregue 25 mM de DTT a las fracciones agrupadas de proteína durante 5-10 minutos.
- Mide el A280 de la proteína y divídelo por el coeficiente de extinción. Además, determine el A343. Calcule la relación de enlace en función de la molaridad de la proteína (A280) y el enlazador (A343).
NOTA: Desactive la calibración automática del A340 si utiliza un espectrofotómetro de nanogotas. La medición A343 representa la absorbancia del grupo piridina 2-tiona (coeficiente de extinción = 7550 M-1) que es eliminado del reticulante SPDP por el TDT. Por lo general, se logra una relación molar de enlace y proteína de 1,2 a 1,5 cuando se realiza la reacción con un exceso de 2,5 molares de SDPD en una amplia gama de proteínas.
- Pase las fracciones agrupadas sobre la columna lavada en PBS como se describe anteriormente. Recoja las fracciones, determine el A280 y agrupe las fracciones superiores. Determine la concentración de proteína por A280 después de agrupar las fracciones.
- Prepare DSPE-PEG(2000)-Maleimida (1,2-distearoyl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000)-maleimida. Esto se agregará a la proteína en una proporción molar de 10:1. Prepare un stock de 100x de DSPE-PEG(2000)-Maleimida para lograr la concentración deseada.
- Por ejemplo, si la concentración de proteína es de 10 μM después del paso 1.14, prepare un stock de DSPE-PEG(2000)-Maleimida a 10 mM. Pesar cuidadosamente DSPE-PEG(2000)-Maleimida (MW = 3000 g/mol) y añadir la cantidad adecuada de DMSO. Múltiples rondas de vórtice suave y sonicación pueden hacer que se disuelva por completo.
- Determine el volumen total de las fracciones del paso 1.14 y transfiera la solución cuidadosamente a un matraz pequeño (10-25 mL) de fondo redondo (RBF). Agregue la cantidad apropiada de 100x DSPE-PEG(2000)-Maleimida a la proteína para lograr una concentración final de 1x 10 veces el exceso molar. Agite suavemente la solución para asegurarse de que el DMSO se disperse por completo.
- Ejecute la reacción durante la noche bajo nitrógeno en un RBF sellado. Use un tabique de goma y colóquelo en una campana extractora.
- Elimine la atmósfera perforando el tabique con una aguja de 20 g conectada a una jeringa de 3 ml en el extremo del tubo conectado a una aspiradora, y encienda la aspiradora durante 3-5 s.
- Reemplace la atmósfera con nitrógeno. Llene un globo conectado a una jeringa de 3 ml cortado por la mitad con nitrógeno y coloque una aguja de 20 g. Perfore el tabique para llenar la atmósfera dentro del matraz de fondo redondo con nitrógeno. Repita la eliminación de la atmósfera y el reemplazo con nitrógeno una vez más y deje el globo de nitrógeno adherido durante la noche.
- Prepare una columna separada de perlas de gel de dextrano reticulado con un rango de fraccionamiento de 4.000 a 150.000 Da en una columna de cromatografía vítrea de 1,0 cm x 50 cm (según los pasos 1.1-1.3).
- Al día siguiente, extraiga la proteína del matraz de fondo redondo preparado en el paso 1.17 y páselo (siga el método utilizado en el paso 1.6) sobre la columna de gel de dextrano reticulado (del paso 1.18).
NOTA: La cantidad total a cargar en la columna no debe ser superior a 2 mL. Si se utilizó una reacción más grande, divídala en dos y corra en columnas separadas o ejecute en una columna de mayor diámetro.
- Recoja las fracciones, determine el A280, las fracciones superiores de la piscina y determine la concentración de proteína. La presencia del lípido no afectará a las mediciones.
- Almacene las fracciones finales agrupadas de proteína ligada a lípidos a 4 °C hasta que estén listas para su uso.
>2. Preparación de liposomas
- Pesar los lípidos: DSPE-PEG(2000) (1,2-distearolel-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000, MW = 2805,5 g/mol; Colesterol (3b-hidroxi-5-colesteno, 5-colesteno-3b-ol), MW = 386,7 g/mol; y DSPC (1,2-distearolel-sn-glicero-3-fosfocolina), MW = 790,1 g/mol. Cree una solución de 5 mg/mL de DSPC, una solución de 4 mg/mL de colesterol y una solución de 2 mg/mL de DSPE-PEG (2000) en cloroformo.
- Asegúrese de que la proporción molar de lípidos en los liposomas sea: 57% DSPC, 38% colesterol y 5% DSPE-PEG (2000), como se representa en la Tabla 1.
NOTA: Es importante controlar la cantidad de antígeno en el liposoma, que generalmente oscila entre el 0,01 y el 0,1%. En la Tabla 1, se utiliza el 0,1% del fragmento de IgM Fab anti-ratón de cabra unido a lípidos pegilados. Es fundamental tener en cuenta el exceso molar de 10 veces de DSPE-PEG(2000)-maleimida que se añadió a la proteína en el paso 1.15, para garantizar que la cantidad total de lípidos pegilados no supere el 5%.
- Tenga en cuenta las cantidades finales de lípidos (μmol) al crear lípidos para la extrusión. En la Tabla 1 se muestra un ejemplo de cálculo de las concentraciones molares de lípidos para la creación de liposomas a una concentración total de lípidos de 1,25 μM.
- Una vez que se haya calculado la cantidad correcta de cada lípido que se va a agregar, combine todo en un tubo de ensayo de vidrio de borosilicato de 12 ml.
- Sople con cuidado el cloroformo.
- Utilice el tubo y una jeringa de 3 ml con una aguja, preparados en el paso 1.17.1, para soplar cuidadosamente el cloroformo del tubo con nitrógeno. Sople suavemente un chorro de nitrógeno sobre la solución mientras gira el tubo con la otra mano. Tenga cuidado de minimizar las salpicaduras o hacer que el líquido corra por el costado del tubo, ya que puede ser más difícil ponerlo en solución en el siguiente paso.
- Agregue 100 μL de DMSO a cada tubo y liofilice esta solución durante la noche. Cubra la parte superior del tubo con una toallita de laboratorio no estática, asegúrelo con una banda elástica y congele a -80 °C.
>3. Extrusión de liposomas
- Agregue 1 mL de PBS que contiene la proteína ligada a lípidos al tubo de 12 mL que contiene los lípidos. Sonicar la solución durante aproximadamente 30 segundos a 1 minuto en un baño de agua de sonicación. Descansa durante 5 minutos o más entre cada ronda y repite 3 o 4 veces.
- Prepare una extrusora según las indicaciones del fabricante.
- Agregue los soportes del filtro al soporte de la membrana interna y coloque unas gotas (10 μL cada una) de PBS sobre la película de parafina. Con unas pinzas, agarre un borde del soporte del filtro y sumérjalo en la gota de 10 μL.
- Coloque el filtro dentro de la junta tórica. Haz esto para ambos lados. Con unas pinzas, agarre un filtro de 0,8 μm en el borde de la gota de 10 μL y cubra el exterior de la junta tórica con PBS. Coloque el filtro de 0,8 μm suavemente en la junta tórica para que el filtro no sobresalga del soporte de la membrana interna.
- Coloque el bloque calefactor de la extrusora en una placa calefactora para precalentar la extrusora. Encienda la placa calefactora a baja temperatura y permita que el bloque calefactor de la extrusora alcance la temperatura deseada. Para evitar posibles problemas con la agregación de proteínas, no caliente el bloque a más de 37 °C.
- Cargue la muestra sonicada en una de las jeringas de extrusión colocadas en la extrusora. Coloque la jeringa del extrusor en el otro extremo del del extrusor. Asegúrese de que el émbolo de la jeringa vacía esté a cero. La jeringa vacía se llenará a medida que el lípido se extruya a través de la membrana de policarbonato de 0,8 μm. Trate de evitar que las burbujas pasen de un lado a otro a través de la membrana.
- Coloque el extrusor completamente ensamblado en el bloque calefactor. Empuje suavemente el émbolo de la jeringa llena con lípidos hasta la jeringa vacía. Dependiendo de la concentración de lípidos, esto será difícil de superar. Repite 20 veces.
- Retire la extrusora completamente ensamblada del bloque calefactor. Retire lentamente la jeringa llena de la extrusora, asegúrese de recoger los lípidos que puedan filtrarse al retirarla. Coloque los liposomas en un frasco limpio. Repita los pasos 3.4 a 3.6 utilizando membranas de policarbonato de 0,2 μm y 0,1 μm.
- Cree una columna de cuentas de agarosa reticulada de 0,7 x 50cm2 con un rango de separación de 0,7-10 Mega Daltons (MDa) equilibrado en PBS. Agregue los liposomas y ejecute como en el paso 1.6. Las fracciones que contienen liposomas tendrán una transmisión de luz disminuida en el rango de 250 a 400 nm.
- Almacene los liposomas a 4 °C y no los congele.
>4. Flujo de calcio para monitorear la activación de células B por liposomas antigénicos
- Sacrificar ratones por sobredosis de dióxido de carbono (CO2) o isoflurano, de acuerdo con los procedimientos operativos estándar institucionales. Confirmar la eutanasia de ratones por luxación cervical.
- Esterilizar los instrumentos quirúrgicos y el cadáver de los ratones con etanol al 70%. Utilice pinzas de iris curvadas de 10 cm de largo y punta de 0,8 mm para separar la piel que cubre la cavidad torácica de la caja torácica. Utilice unas tijeras de disección rectas de 10 cm de largo para hacer una incisión distal con una incisión bilateral.
- Use pinzas de iris curvadas y tijeras de disección para extraer el bazo de la cavidad abdominal. Retire el tejido graso que rodea el bazo y luego colóquelo en un tubo cónico de poliestireno de 15 ml lleno de medio RPMI1640 que contiene 1% de suero fetal de ternera (FCS) y penicilina-estreptomicina.
- Transfiera el bazo y los medios a través de un filtro de células de 40 μm instalado en un tubo cónico de 50 mL. Con el extremo de goma de un émbolo de jeringa de 3 ml, triture suavemente el bazo. Lave el filtro de células de 40 μm con el medio. Repita este proceso hasta que solo quede tejido graso en el filtro de células de 40 μm. Enjuague el tamiz con 3-5 mL de medio para aumentar la recuperación celular.
- Homogeneizar la célula centrífuga a 300 x g durante 5 min en RT. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y agregue 10 mL de 1x tampón de lisis RBC al pellet. Pipetear hacia arriba y hacia abajo, dejar actuar durante 2-3 min en RT y, a continuación, centrifugar a 300 x g durante 5 min en RT.
- Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender los esplenocitos agotados en glóbulos rojos en 10 mL de medio. Determine el número total de células usando un hemocitómetro u otro dispositivo de conteo de células. Granule las células por centrifugación como se describe anteriormente.
NOTA: La concentración final ideal necesaria para la carga de Indo-1 de los esplenocitos es de 10-20 x 106 células/mL, pero se puede utilizar una concentración más baja de células.
- Resuspender los esplenocitos a 15 x 106 células/mL en tampón de carga de flujo de calcio (Roswell Park Memorial Institute, RPMI1640 medio que contiene 1% de FCS, 10mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinenetanosulfónico (HEPES), 1mM de cloruro de magnesio (MgCl2), 1mM de etilenglicol-bis(β-aminoetiléter)-N, N,N', N'-ácido tetraacético (EGTA) y 5% de penicilina-estreptomicina). Agregue 1,5 μM de Indo-1 de una solución madre de DMSO de 1 mM e invierta el tubo varias veces para mezclar. Proteger de la luz e incubar las células a 37 °C en baño de agua durante 30 min.
- Después de la incubación de 30 minutos, agregue 5 veces la cantidad de tampón de carga de flujo de calcio. Centrífuga a 300 x g durante 7 min en RT.
- Para la compuerta en células B, tiñir las células con CD5-PE anti-ratón 1:200 y 1:200 B220-PE/Cy7 antiratón en 0,5 mL de tampón de carga a 4 °C durante 20 min, protegidas de la luz.
- Lave los esplenocitos en un tampón de carga de flujo de calcio y centrifugue a 300 x g durante 7 min en RT. Vuelva a suspender las células a 10–20 x 106 células/mL en tampón de flujo de calcio (solución salina equilibrada de Hank (HBSS) que contiene 1% de FCS, 1 mM de MgCl2 y 1 mM de cloruro de calcio (CaCl2)). Almacene en hielo, protegido de la luz hasta que esté listo para funcionar en el citómetro de flujo.
- Configure la citometría de flujo con controles de tinción única y sin tinción para la compensación.
- Ejecute las celdas teñidas para configurar las puertas correctamente (consulte la Figura 1A). Configure el gráfico Indo-1 (violeta) frente a Indo-1 (azul), ajuste los voltajes en los canales Indo-1 para colocar las células que se tiñen en una pendiente de 45-60° para maximizar la relación señal:ruido del Indo-1 violeta: cambio de azul en la relación después de la estimulación de las células B.
NOTA: Asegúrese de que los voltajes no sean demasiado altos, de modo que un porcentaje significativo de las celdas (>5%) estén contra la parte superior de la gráfica.
- Cree una puerta diagonal que encapsule la parte superior izquierda (Violeta + Azul-) de la parcela, de modo que sin estimulación el <10% de las células estén en la puerta, que idealmente debería aumentar a >75% después de la estimulación.
- Añada 0,5 mL de células a un tubo de poliestireno de fondo redondo de 5 mL tapado (tubo de clasificación de células activado por fluorescencia (FACS)) y caliente las células a 37 °C durante 3-5 min en un baño de agua. Coloque el tubo FACS en la cámara con camisa de agua a 37 °C que está conectada a un baño de agua de recirculación.
- Ejecute el tubo en la camisa de agua del citómetro de flujo e inicie la adquisición, sin almacenar los datos, a aproximadamente 5.000-10.000 eventos/s. Una vez que las celdas se hayan estabilizado (15-30 s), inicie la adquisición de datos y recopile datos durante al menos 10 s para establecer el fondo.
- En la marca de 10 mocos, retire rápidamente el tubo del citómetro de flujo, agregue la estimulación (liposomas antigénicos de 5-50 μM en 2-20 μL), vórtice de pulso y devuelva el tubo FACS al citómetro de flujo. Mantenga la adquisición y el almacenamiento de datos durante este tiempo y recopile datos durante 3 a 5 minutos.
- Analice los datos en el software de análisis adecuado bajo las funciones cinéticas.
Tabla 1: Cálculos para crear un liposoma de concentración total de lípidos de 1,25 μM.Ejemplo de tabla de cálculo para liposomas de fragmentos de IgM F(ab) anti-ratón en cabras.
| Mw | 790 | Artículo 387 | 2900 | 3000 | 48000 | |
| DSPC | colesterol | PEG-DSPE | exceso de PEG-DSPE | aIgM-PEG-DSPE | total |
| Relación molar | 57 | 38 | 3.9 | 1 | 0.1 | 100.00 |
| Masa (mg) | 0.56 | 0.18 | 0.14 | 0.04 | 0.06 | 0.98 |
| MMOL | 0.71 | 0.47 | 0.05 | 0.01 | 0.00 | 1.25 |
| Ml | 112.50 | 45.93 | 70.64 | 0.00 | 525.97 | 755.03 |
| | | Conc. (mg/mL) | | | |
| | DSPC | 5 | | | |
| | colesterol | 4 | | | |
| | PEG-DSPE | número arábigo | | | |
| | aIgM-PEG-DSPE | 0.114 | | | |
