Concentración de proteínas filtradas de cultivo bacteriano mediante un dispositivo de ultrafiltración

Resumen

Fuente: Ryan, J. M., et al. Mycobacterium tuberculosis Enriquecimiento de vesículas extracelulares mediante cromatografía de exclusión por tamaño. J. Vis. Exp. (183) (2022)

Este video demuestra el aislamiento y la concentración de proteínas filtradas de cultivo bacteriano, que incluyen vesículas extracelulares bacterianas, utilizando ultrafiltración. Las vesículas extracelulares concentradas sirven como marcadores diagnósticos para la detección de enfermedades.

Protocolo

1. Preparación de concentrado crudo de vesículas extracelulares (EV) de Mycobacterium tuberculosis (Mtb)

NOTA: Para procedimientos detallados sobre el cultivo de Mtb y la preparación de la proteína filtrada de cultivo (CFP). Se recomienda que los medios de cultivo bacteriano estén libres de suplementos de crecimiento con componentes proteicos o que contengan EV, como la albúmina oleica dextrosa catalasa (OADC) y detergentes como Tween. También se recomienda que la calidad del cultivo bacteriano y el CFP cosechado se examinen para garantizar una muerte y lisis celular limitadas.

1. Prepare un filtro centrífugo de corte de peso molecular (MWCO) de 100 kDa (consulte la tabla de materiales) agregando la capacidad de volumen total de solución salina tamponada con fosfato (1x PBS). Centrífuga durante 5 min a 2.800 x g a 4 °C.
   NOTA: Siutilizo un filtro sin volumen de parada muerta, se debe tener cuidado para garantizar que el volumen de la muestra no se reduzca por debajo del nivel del filtro, lo que resulta en un secado completo del filtro durante la centrifugación.
2. Deseche el flujo continuo y cualquier PBS restante antes de llenar la cámara de muestras con Mtb CFP a su capacidad máxima. Centrifugar a 2.800 x g a 4 °C hasta que el volumen se haya reducido al volumen mínimo del dispositivo de ultrafiltración. Repita según sea necesario, agregando más CFP a la unidad hasta que toda la muestra se haya reducido lo suficiente.
   nota: Retenga una parte del material de flujo continuo de 100 kDa (100F) para la calificación aguas abajo si lo desea. Conservar a 4 °C.
3. Agregue 1x PBS a la unidad de filtro que contiene el concentrado hasta la capacidad total del dispositivo. Reduzca el volumen como se describe en 1.2. Repita este paso cinco veces para asegurar el lavado completo y el cambio de tampón.
4. Recuperar el retenido concentrado de CFP de 100 kDa (100R) de acuerdo con las especificaciones del dispositivo de ultrafiltración (ver Tabla de Materiales). Una vez que se recupere el 100R, lave el filtro con un volumen mínimo de 1x PBS al menos tres veces y agrupe el lavado con el 100R para maximizar la recuperación.
5. Cuantifique el material 100R con un ensayo bicinconínico (BCA) siguiendo las instrucciones del fabricante (consulte la tabla de materiales). Para realizar el ensayo, utilice varias diluciones de muestras 1:2, 1:5 y 1:10 en PBS. Pruebe la muestra por triplicado.
   nota: Conserve una parte del material 100R para la calificación posterior si lo desea. Conservar a 4 °C.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Colector automático de fracciones	Ciencia IZON	AFC-V1-USD
Centricon Plus - 70 Filtro centrífugo, corte de 100 kDa	Millipore Sigma	UFC710008	Dispositivo de ultrafiltración utilizado en el paso 1.1
Solución salina tamponada con fosfato, 1X sin calcio ni magnesio	Corning	21-040-CV
Membrana de nitrocelulosa, rollo, 0,2 μm	BioRad	1620112