1. Preparación de concentrado crudo de Mtb EV
NOTA: Para conocer los procedimientos detallados sobre el cultivo de Mtb y la preparación de la proteína filtrada de cultivo (CFP), consulte Referencias. Se recomienda que los medios de cultivo bacteriano estén libres de suplementos de crecimiento con componentes proteicos o que contengan EV, como la albúmina oleica dextrosa catalasa (OADC) y detergentes como Tween. También se recomienda que la calidad del cultivo bacteriano y el CFP cosechado se examinen para garantizar una muerte y lisis celular limitadas.
- Prepare un filtro centrífugo de corte de peso molecular (MWCO) de 100 kDa (consulte la tabla de materiales) agregando la capacidad de volumen total de solución salina tamponada con fosfato (1x PBS). Centrífuga durante 5 min a 2.800 x g a 4 °C.
nota: Si se utiliza un filtro sin volumen de parada muerta, se debe tener cuidado para asegurarse de que el volumen de la muestra no se reduzca por debajo del nivel del filtro, lo que resulta en un secado completo del filtro durante la centrifugación.
- Deseche el flujo continuo y cualquier PBS restante antes de llenar la cámara de muestras con Mtb CFP a su capacidad máxima. Centrifugar a 2.800 x g a 4 °C hasta que el volumen se haya reducido al volumen mínimo del dispositivo de ultrafiltración. Repita según sea necesario, agregando más CFP a la unidad hasta que toda la muestra se haya reducido lo suficiente.
nota: Retenga una parte del material de flujo continuo de 100 kDa (100F) para la calificación aguas abajo si lo desea. Conservar a 4 °C.
- Agregue 1x PBS a la unidad de filtro que contiene el concentrado hasta la capacidad total del dispositivo. Reduzca el volumen como se describe en 1.2. Repita este paso cinco veces para asegurar el lavado completo y el cambio de tampón.
- Recuperar el retenido concentrado de CFP de 100 kDa (100R) de acuerdo con las especificaciones del dispositivo de ultrafiltración (ver Tabla de Materiales). Una vez que se recupere el 100R, lave el filtro con un volumen mínimo de 1x PBS al menos tres veces y agrupe el lavado con el 100R para maximizar la recuperación.
- Cuantifique el material 100R con un ensayo bicinconínico (BCA) siguiendo las instrucciones del fabricante (consulte la tabla de materiales). Para realizar el ensayo, utilice varias diluciones de muestras 1:2, 1:5 y 1:10 en PBS. Pruebe la muestra por triplicado.
nota: Conserve una parte del material 100R para la calificación posterior si lo desea. Conservar a 4 °C.
>2. Cromatografía de exclusión por tamaño para el enriquecimiento de Mtb EVs a partir de CFP
NOTA: El siguiente procedimiento es específico para usar 3 mg de CFP 100R Mtb con columna SEC y colector automático de fracciones (AFC, ver Tabla de Materiales). Se puede adaptar a otras concentraciones iniciales y tipos de columnas siguiendo las especificaciones del fabricante. Además, se recomienda a los usuarios que lean y comprendan el manual del usuario del colector automático de fracciones.
- Permita que la columna SEC se equilibre a temperatura ambiente.
- Encienda el AFC usando el interruptor de encendido en la parte posterior de la unidad de torre y ajuste la configuración de la celda de carga, si es necesario, presionando SETUP en la pantalla táctil del menú principal. La célula de carga solo debe calibrarse en el primer uso, después de cada actualización de software, y si se observan inconsistencias en los volúmenes de recolección de fracciones.
- En la pantalla CONFIGURACIÓN, alinee el carrusel seleccionando CARRUSEL > CALIBRAR. Inserte el carrusel con los 13 orificios pequeños hacia arriba en la torre AFC y ajuste el carrusel para que la boquilla de fluido esté directamente encima de la posición de descarga presionando los botones - y/o +.
- Retire las tapas de la columna SEC equilibrada. Deslice la columna SEC en el soporte de columna apropiado e instálela con cuidado en la torre AFC. Asegúrese de que la etiqueta de identificación por radiofrecuencia (RFID) de la columna esté orientada hacia el AFC y compruebe que la conexión entre la columna y la válvula sea segura. Coloque el tubo de salida de residuos en un recipiente de recolección.
- En la pantalla CONFIGURACIÓN, seleccione Programación de recolección y establezca el conteo en 13 y el tamaño en 0.5 mL presionando los botones - y/o +. Deje la configuración "Volumen de búfer" como predeterminada de 2,7 ml y luego cierre la ventana "Programación de recolección" presionando X.
- Seleccione INICIAR COLECCIÓN en la pantalla de inicio y confirme los parámetros de recopilación seleccionando SÍ. Cargue 13 tubos de microcentrífuga de 1,7 ml etiquetados con las tapas abiertas y apuntando hacia el centro del carrusel.
- Avance el AFC seleccionando OK, luego monte el depósito de columna y avance nuevamente presionando OK. Seleccione la opción para vaciar la columna pulsando SÍ y añada un volumen de columna de PBS filtrado de 0,2 μm para eliminar cualquier búfer de almacenamiento. Una vez que se complete el lavado, avance el AFC presionando OK.
- Coloque la cubierta del carrusel sobre el AFC y presione OK. Prepare un volumen de columna de PBS filtrado de 0,2 μm. Utilice una pipeta para eliminar el exceso de tampón de la columna.
- Lleve 3 mg de muestra 100R cuantificada en el paso 1.5 a 500 μL con 1x PBS. Agregue la muestra de 3 mg en la parte superior de la columna. Avance el AFC y permita que la muestra se escurra en la frita. Una vez que la muestra haya entrado completamente en la columna, agregue el PBS preparado en el paso 2.6 al depósito.
- Supervise la ejecución del AFC mientras recoge primero el volumen vacío y luego las fracciones especificadas. Una vez que se complete el recorrido y el carrusel vuelva a la posición de desecho, retire la tapa y retire los tubos de fracción del carrusel. Almacene las fracciones a 4 °C antes de la cuantificación (paso 3) y la calificación (paso 4).
- Si la columna se va a reutilizar, seleccione la opción para limpiar la columna pulsando SÍ; de lo contrario, pulse NO. Siga las instrucciones en el archivo AFC.
NOTA: Una vez que se ha lavado la columna y se ha agotado el búfer de almacenamiento, se puede quitar, tapar y almacenar a 4 °C.