Una técnica para cuantificar la infección fúngica en larvas de pez cebra

Resumen

Fuente: Thrikawala, S., et al. Infección de larvas de pez cebra con esporas de Aspergillus para el análisis de las interacciones huésped-patógeno. J. Vis. Exp. (2020).

Este video muestra un método para cuantificar la infección fúngica en larvas de pez cebra. Las esporas de hongos se microinyectan en el ventrículo posterior del cerebro de las larvas y las larvas se incuban para permitir el desarrollo de la infección. Las larvas infectadas se recolectan a intervalos definidos y el progreso de la infección se evalúa mediante la enumeración de las unidades formadoras de colonias.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

>1. Preparación de esporas de Aspergillus para inyección

1. A partir de una suspensión de esporas de Aspergillus, calcule el volumen necesario para obtener 1 x 10⁶ esporas. El volumen debe ser de 20 a 100 μL; de lo contrario, producir una dilución 10x en Tween-20 estéril al 0,01% (v/v) (Tween-water; Tabla de Materiales). Por ejemplo, si el volumen calculado es de 5 μL, produzca una dilución de 10x....

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Pinzas Dumont #5	Roboz Instrumento Quirúrgico Co.	RS-5045
Retícula del ocular	Mundo del Microscopio	RETR10	Para calibrar agujas, utilizado en microscopio estereoscópico
Configuración del microinyector: Unidad de contrapresión	Instrumentación Científica Aplicada	BPU
Interruptor de pedal	Instrumentación Científica Aplicada	FTSW
Kit de soporte de micropipetas	Instrumentación Científica Aplicada	M-pip
Inyector de presión	Instrumentación Científica Aplicada	MPPI-3
Configuración del micromanipulador: Micromanipulador	Narashige (Tritech)	M-152
Soporte y placa magnética	Tritech	MINJ-HBMB
Tirador de agujas	Instrumento Sutter	P-97
Microscopio estereoscópico	Nikon	SMZ-745
Analizador de tejidos II	Qiagen	85300	Para homogeneizar las larvas
material
agarosa	pescador	BP160-500
Ampicilina sódica sal	pescador	AAJ6380706
BSA, fracción V	VWR	AAJ65855-22
Sulfato de kanamicina	pescador	AAJ1792406
Esparcidores L	pescador	14 665 230
Agujas microcapilares (sin filamento)	Instrumentos Mundiales de Precisión (WPI)	TW100-3
Puntas de pipeta con microcargador	VWR	89009-310	Para cargar la aguja con suspensión de Aspergillus
Mirapaño	VWR	EM475855-1R	Para filtrar la suspensión de Aspergillus
N-feniltiourea	pescador	AAL0669009	Para prevenir la pigmentación
Rojo de fenol, solución al 1%	pescador	57254
Tricaína (3-aminobenzoato de etilo, sal de ácido metanosulfónico)	pescador	AC118000500	Para anestesiar larvas
Preadolescente-20	pescador	BP337-500
Medios y soluciones			Componentes/Receta
Medios E3: 60x E3			17,2 g de NaCl, 0,76 g de KCl, 2,9 g de CaCl2, 4,9 g de MgSO4 · 7H2O, a 1 L con H2O
1x E3			16,7 ml 60x caldo, 430 ul 0,05 M NaOH, a 1 L con H2O (opcional: + 3 ml 0,01% azul de metileno)
Solución madre de tricaína			2 g de Tricaína, 5 g Na, 2, HPO4 · 7H,2O, 4,2 ml, 60X, E3, a 500 ml conH2O, pH a 7,0-7,5 con NaOH
Agar de medios mínimos de glucosa (GMM): agar GMM			10 g de glucosa (dextrosa), 50 ml 20x sales de nitrato, 1 ml de TE, a 1 L con H2O, pH a 6,5 con NaOH, + 16 g de agar, autoclave
20x Sales de nitrato			120 g NaNO3, 10,4 g KCl, 10,4 g, MgSO4 · 7H2O, 30,4 g, KH2PO4, a 1 L con H2O, autoclave
Oligoelementos (TE)			2,20 g ZnSO4 · 7H2O, 1,10 g H3BO3, 0,50 g MnCl2 · 4H2O, 0,16 g FeSO4 · 7H2O, 0,16 g CoCl2 · 6H2O, 0,16 g CuSO4 · 5H2O, 0,11 g (NH4)6Mo7O24 · 4H2O, 5,00 g de Na2EDTA, a 100 ml con H2O, disolver agitando durante la noche, autoclave