Una técnica para cuantificar la infección fúngica en larvas de pez cebra

Resumen

Fuente: Thrikawala, S., et al. Infección de larvas de pez cebra con esporas de Aspergillus para el análisis de las interacciones huésped-patógeno. J. Vis. Exp. (2020).

Este video muestra un método para cuantificar la infección fúngica en larvas de pez cebra. Las esporas de hongos se microinyectan en el ventrículo posterior del cerebro de las larvas y las larvas se incuban para permitir el desarrollo de la infección. Las larvas infectadas se recolectan a intervalos definidos y el progreso de la infección se evalúa mediante la enumeración de las unidades formadoras de colonias.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

>1. Preparación de esporas de Aspergillus para inyección

1. A partir de una suspensión de esporas de Aspergillus, calcule el volumen necesario para obtener 1 x 10⁶ esporas. El volumen debe ser de 20 a 100 μL; de lo contrario, producir una dilución 10x en Tween-20 estéril al 0,01% (v/v) (Tween-water; Tabla de Materiales). Por ejemplo, si el volumen calculado es de 5 μL, produzca una dilución de 10x y utilice 50 μL de la solución diluida.
   nota: Se pueden preparar dos placas/cepas para recoger más esporas o como repuesto en caso de contaminación.
2. Extienda 1 x 10⁶ esporas de Aspergillus en una placa de medios mínimos de glucosa (GMM) (Tabla de Materiales) con un esparcidor estéril desechable en forma de L en un gabinete de bioseguridad. Evite esparcir hasta el borde del plato. Incubar a 37 °C durante 3-4 días, con la placa boca abajo.
3. El día de la recolección, lleve al gabinete de bioseguridad el paño de miralla estéril y los tubos cónicos de 50 mL (dos por cepa), botellas frescas de agua Tween-water estéril (una por cepa) y esparcidores estériles desechables en forma de L.
   nota: Miracloth se puede cortar en ~ 8 pulgadas x 6 en trozos, envolver en papel de aluminio y esterilizar en autoclave.
4. Coloque un pedazo de pila en cada tubo cónico de 50 mL etiquetado y vuelva a taparlo. Saca el paquete de mirapel restante del capó.
5. Lleve las placas al gabinete de bioseguridad. Abra un plato, luego vierta agua Tween-water en la parte superior para cubrir aproximadamente tres cuartas partes del plato.
6. Con un esparcidor desechable en forma de L, raspe suavemente la superficie del cultivo de hongos con un movimiento de adelante y hacia atrás, mientras usa la otra mano para girar la placa. Raspe hasta que casi todas las esporas se homogeneicen en el agua de preadolescencia.
   nota: Debido a la alta hidrofobicidad, las esporas pueden crear "bocanadas" cuando se agrega agua Tween o durante el raspado. Se debe tener mucho cuidado para evitar la contaminación de los tubos o placas cercanas. Se aconseja cambiar los guantes y limpiar la superficie con etanol al 70% entre la extracción de las diferentes cepas.
7. Tome un tubo cónico de 50 mL y retire el trozo de miracloth. Dóblalo por la mitad y conviértelo en un filtro insertado en la parte superior del tubo cónico de 50 ml.
8. Vierta el homogeneizado de hongos de la placa sobre el paño mirala en el tubo.
   nota: Si se preparan dos placas de una cepa, raspe ambas placas y viértalas en el mismo tubo cónico.
9. Vierta el agua de la interpolación para que el volumen total del tubo cónico sea de 50 ml.
10. Centrifugar a 900 x g durante 10 min. Asegúrese de utilizar tapones que eviten la aerosolización en la centrífuga.
11. Vierta el sobrenadante en una solución de lejía de ~ 10% para descontaminar. Vierta 50 ml de PBS estéril 1x en el tubo cónico, luego agite o agite para volver a suspender el pellet.
12. Girar de nuevo a 900 x g durante 10 min. Vierta el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 5 mL de 1x PBS estéril. Filtre a través de un trozo de paño de miraña en un tubo cónico nuevo de 50 ml.
13. Realice diluciones en serie de 10 veces (10x, 100x, 1000x) del homogeneizado fúngico en tubos de centrífuga de 1,7 mL (por ejemplo, para la solución 10x, mezcle 100 μL del homogeneizado fúngico con 900 μL de agua Tween).
14. Elija la primera dilución en la que las esporas no sean visibles cuando se descarga en el agua de interpolación y use esta dilución para contar el número de esporas usando un hemocitómetro.
15. Calcule la concentración de esporas en el homogeneizado fúngico preparado (suspensión acuosa) utilizando la siguiente fórmula:
    Concentración (esporas/mL) = Número de esporas en el medio: 25 cajas x factor de dilución x 10⁴
16. Prepare un stock de 1 mL de 1,5 x 10⁸ esporas/mL en 1x PBS estéril en un tubo de microcentrífuga de 1,7 mL. Esta preparación de esporas se puede almacenar a 4 °C durante ~4 semanas.
17. Antes de usar en inyecciones, mezcle 20 μL de la preparación de esporas con 10 μL de rojo de fenol estéril al 1% en un tubo de centrífuga de 1,7 mL para lograr una concentración final de esporas de 1 x 10⁸ esporas/mL. Vórtice minuciosamente antes de la inyección.
    NOTA: La solución de rojo de fenol al 1% debe esterilizarse por filtro y almacenarse en alícuotas.
18. Para una inyección simulada, mezcle 20 μL de 1x PBS con 10 μL de rojo de fenol estéril al 1%.

>2. Preparación de placas de agar para inyección

1. Preparar agarosa al 2% en medio E3 y derretir en el microondas.
2. Vierta en una placa de Petri de 100 mm x 15 mm (~ 25 ml por placa), revuelva para cubrir la placa de manera uniforme y deje enfriar.
3. Envuelva el plato con film de parafina y guárdelo invertido a 4 °C.
4. Antes de la inyección, lleve la placa a temperatura ambiente (RT).
5. Vierta ~ 1 mL de albúmina sérica bovina (BSA) al 2% esterilizada por filtro en la placa, incline la placa para extender y cubrir todo el fondo, y enjuague con E3.
   NOTA: La solución de BSA al 2% puede esterilizarse por filtro y almacenarse como alícuotas de 1 mL a -20 °C. El pretratamiento con BSA al 2% evita que las larvas se adhieran a la superficie de la agarosa.
6. Vierta E3 con tricaña tamponada en el plato y déjelo reposar hasta la inyección.

>3. Microinyección del ventrículo posterior de la larva del pez cebra

1. Decorionar manualmente las larvas con pinzas a los 2 días después de la fertilización (dpf) en una placa de Petri.
   nota: La decorionación se puede realizar en cualquier momento desde 1,5 dpf hasta el momento de la inyección.
2. Retire la mayor cantidad posible de E3 de la placa de Petri y agregue 300 μg/mL de tricaína tamponada en E3 para anestesiar las larvas.
   nota: Se puede preparar y almacenar a 4 °C una solución madre de 4 mg/ml de tricaína tamponada en E3. La solución de trabajo se puede preparar diluyendo 4 mL de la solución madre hasta 50 mL con E3.
3. Utilice una configuración de microinyección suministrada con el inyector de presión, la unidad de contrapresión, el interruptor de pie, el soporte de micropipeta, el micromanipulador y un soporte y una placa magnéticos, todos conectados a una fuente de aire comprimido (Tabla de materiales).
4. Abra la válvula de aire comprimido y encienda el microinyector. Ajuste la presión a ~ 25 PSI, la duración del pulso a 60 ms y la unidad de contrapresión a 1 PSI.
5. Cargue una aguja de microinyección con la punta de una pipeta de microcargador (Tabla de materiales) con aproximadamente 3-5 μL de PBS preparado o suspensión de esporas con rojo de fenol. Monte la aguja en el micromanipulador.
   nota: Las agujas de microinyección se pueden preparar como se describió anteriormente. El microscopio estereoscópico utilizado para las microinyecciones debe tener una retícula ocular para calibrar la aguja de microinyección. La retícula debe calibrarse con un micrómetro de etapa y se debe determinar la longitud de la escala de la retícula (μm). El diámetro de la gota de suspensión de esporas que expulsa de la aguja se mide en función del número de hashes (de la retícula) que se superponen con la gota.
6. Coloque el micromanipulador de modo que el extremo de la aguja quede a la vista con el aumento más bajo el microscopio estereoscópico. Acérquese a un aumento de 4x, manteniendo la aguja a la vista.
7. Con pinzas afiladas, corte el extremo de la aguja. Presione el pedal de inyección para visualizar el tamaño de la gota que sale. Siga recortando hasta que se inyecten ~ 3 nL de suspensión de esporas (aquí, esto es cinco hashes).
8. Mueva el micromanipulador y la aguja fuera del camino para evitar golpear accidentalmente la aguja mientras las larvas están dispuestas en la placa de inyección.
9. Vierta E3-Tricaína de la placa de inyección, luego transfiera ~ 24 larvas anestesiadas a la placa de inyección con la menor cantidad de E3 posible utilizando una pipeta de transferencia.
10. Usando una herramienta pequeña para manipular larvas de pez cebra (es decir, una herramienta de bucle para el cabello o una herramienta para pestañas), organice las larvas de acuerdo con la dirección en la que miran. Específicamente, coloque todos los que miran hacia la derecha en una fila, y todos los que miran hacia la izquierda en una fila debajo.
    nota: Esta disposición es difícil si hay demasiado líquido en el plato, ya que las larvas "flotarán" fuera de lugar. Sin embargo, la falta de líquido también es problemática si las inyecciones tardan mucho tiempo, ya que las larvas pueden secarse o desaparecer el efecto de la anestesia. Por lo tanto, se debe prestar especial atención a la cantidad de líquido en la placa durante todo el proceso de microinyección.
11. Ajuste el zoom del microscopio al aumento más bajo. Lleve el micromanipulador hacia atrás y colóquelo de modo que la aguja quede cerca de las larvas, en un ángulo de ~30°-60°, en el centro del campo de visión.
12. Acérquese al aumento más alto y use las perillas de ajuste fino para ajustar aún más la posición de la aguja. Verifique que salgan ~ 30-70 esporas de la aguja inyectando la suspensión de esporas en el líquido en la placa junto a las larvas. Ajuste el tiempo y la presión en la configuración de la inyección, si es necesario.
    nota: Esta prueba debe repetirse cada cinco o seis larvas, ya que el número de esporas que salen de la aguja puede aumentar o disminuir con el tiempo.
13. Comenzando con la fila en la que las larvas miran hacia la aguja, mueva la placa de modo que la aguja quede directamente encima y se coloque cerca de las primeras larvas.
14. Moviendo la aguja con el micromanipulador, inserte la aguja a través del tejido alrededor de la vesícula ótica para perforar el ventrículo posterior del cerebro. Mueva la placa con la otra mano según sea necesario para obtener la orientación correcta de la larva con el ángulo de la aguja.
15. Verifique visualmente que el extremo de la aguja esté en el centro del ventrículo del cerebro posterior, presione el pedal para inyectar esporas y retraiga suavemente la aguja><. nota: El tinte rojo de fenol debe permanecer principalmente dentro del ventrículo posterior del cerebro. Una pequeña cantidad puede entrar en el mesencéfalo, pero no debe llegar al prosencéfalo ni fuera del cerebro. Si lo hace, el volumen que se inyecta es demasiado grande y la presión y el tiempo deben disminuirse en consecuencia, o se debe calibrar una nueva aguja.
16. Moviéndose hacia abajo en el plato, inyecte todas las larvas en esa fila. Luego, dé la vuelta a la placa e inyecte todas las larvas en la otra fila.
    nota: Las larvas inyectadas sin éxito o dañadas accidentalmente se pueden marcar 1) inyectando en la yema un par de veces para crear una marca roja o 2) arrastrando la larva fuera de la fila con la aguja.
17. Mueve la aguja hacia arriba y fuera del camino de nuevo. Aléjese a un aumento más bajo en el microscopio. El tinte rojo fenol aún debe ser visible en el cerebro posterior de cada larva.
18. Primero, retírelo con una herramienta de bucle para el cabello y pipetee para eliminar cualquier larva con inyecciones infructuosas. Transfiera las larvas restantes a una nueva placa de Petri lavándolas de la placa con E3 estéril fresco y una pipeta de transferencia.
19. Repita según sea necesario para el número de muestra experimental final deseado.
20. Enjuague las larvas al menos 2 veces con E3 y asegure la recuperación de la anestesia.
21. Para cuantificar la supervivencia sin ningún tratamiento adicional, utilizando una pipeta de transferencia, transfiera las larvas a una placa de 96 pocillos (1 larva por pocillo) en E3.

>4. Establecimiento del número de esporas inyectadas y viables

1. Inmediatamente después de la inyección, utilizando una pipeta de transferencia, elija al azar unas ocho de las larvas inyectadas y transfiéralas a tubos de centrífuga de 1,7 ml (una larva por tubo).
2. Eutanasiar las larvas con tricaína o colocándolas a 4 °C durante 0,5-2,0 h.
3. Prepare 1 mL de 1 mg/mL de soluciones antibióticas de ampicilina y 0,5 mg/mL de kanamicina en 1x PBS estéril. La solución sobrante puede almacenarse a 4 °C y utilizarse más tarde.
   nota: Las soluciones madre de ampicilina a 100 mg/mL y kanamicina a 50 mg/mL pueden prefabricarse, esterilizarse con filtro y almacenarse en alícuotas a -20 °C. Diluya estas 100 veces en 1x PBS para obtener la solución de trabajo.
4. Con una pipeta, retire la mayor cantidad de líquido posible del tubo de centrífuga, dejando atrás la larva, y agregue 90 μL del 1x PBS con antibióticos.
   nota: Los antibióticos se utilizan para prevenir el crecimiento bacteriano en las placas GMM que pueden interferir con el recuento de las colonias de Aspergillus.
5. Homogeneizar las larvas en un lisador de tejidos a 1.800 oscilaciones/min (30 Hz) durante 6 min. Centrifugar a 17.000 x g durante 30 s.
6. Etiquete las placas GMM (una placa por larva homogeneizada). Utilizando un mechero Bunsen para crear un ambiente estéril, pipetee la suspensión homogeneizada desde un tubo hasta el centro de la placa GMM, luego extiéndala con un esparcidor desechable en forma de L. Evite esparcir el homogeneizado contra el borde.
7. Incubar las placas boca abajo a 37 °C durante 2-3 días y contar el número de colonias formadas (UFC).
8. Para medir el número de esporas vivas durante el período de infección, recoja las larvas de las placas de 96 pocillos entre 1 y 7 días después de la inyección (ppp) y transfiéralas a los tubos de centrífuga. Eutanasiar y homogeneizar las larvas para esparcirlas en placas GMM como se describe en los pasos 4.1-4.5.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Pinzas Dumont #5	Roboz Instrumento Quirúrgico Co.	RS-5045
Retícula del ocular	Mundo del Microscopio	RETR10	Para calibrar agujas, utilizado en microscopio estereoscópico
Configuración del microinyector: Unidad de contrapresión	Instrumentación Científica Aplicada	BPU
Interruptor de pedal	Instrumentación Científica Aplicada	FTSW
Kit de soporte de micropipetas	Instrumentación Científica Aplicada	M-pip
Inyector de presión	Instrumentación Científica Aplicada	MPPI-3
Configuración del micromanipulador: Micromanipulador	Narashige (Tritech)	M-152
Soporte y placa magnética	Tritech	MINJ-HBMB
Tirador de agujas	Instrumento Sutter	P-97
Microscopio estereoscópico	Nikon	SMZ-745
Analizador de tejidos II	Qiagen	85300	Para homogeneizar las larvas
material
agarosa	pescador	BP160-500
Ampicilina sódica sal	pescador	AAJ6380706
BSA, fracción V	VWR	AAJ65855-22
Sulfato de kanamicina	pescador	AAJ1792406
Esparcidores L	pescador	14 665 230
Agujas microcapilares (sin filamento)	Instrumentos Mundiales de Precisión (WPI)	TW100-3
Puntas de pipeta con microcargador	VWR	89009-310	Para cargar la aguja con suspensión de Aspergillus
Mirapaño	VWR	EM475855-1R	Para filtrar la suspensión de Aspergillus
N-feniltiourea	pescador	AAL0669009	Para prevenir la pigmentación
Rojo de fenol, solución al 1%	pescador	57254
Tricaína (3-aminobenzoato de etilo, sal de ácido metanosulfónico)	pescador	AC118000500	Para anestesiar larvas
Preadolescente-20	pescador	BP337-500
Medios y soluciones			Componentes/Receta
Medios E3: 60x E3			17,2 g de NaCl, 0,76 g de KCl, 2,9 g de CaCl2, 4,9 g de MgSO4 · 7H2O, a 1 L con H2O
1x E3			16,7 ml 60x caldo, 430 ul 0,05 M NaOH, a 1 L con H2O (opcional: + 3 ml 0,01% azul de metileno)
Solución madre de tricaína			2 g de Tricaína, 5 g Na, 2, HPO4 · 7H,2O, 4,2 ml, 60X, E3, a 500 ml conH2O, pH a 7,0-7,5 con NaOH
Agar de medios mínimos de glucosa (GMM): agar GMM			10 g de glucosa (dextrosa), 50 ml 20x sales de nitrato, 1 ml de TE, a 1 L con H2O, pH a 6,5 con NaOH, + 16 g de agar, autoclave
20x Sales de nitrato			120 g NaNO3, 10,4 g KCl, 10,4 g, MgSO4 · 7H2O, 30,4 g, KH2PO4, a 1 L con H2O, autoclave
Oligoelementos (TE)			2,20 g ZnSO4 · 7H2O, 1,10 g H3BO3, 0,50 g MnCl2 · 4H2O, 0,16 g FeSO4 · 7H2O, 0,16 g CoCl2 · 6H2O, 0,16 g CuSO4 · 5H2O, 0,11 g (NH4)6Mo7O24 · 4H2O, 5,00 g de Na2EDTA, a 100 ml con H2O, disolver agitando durante la noche, autoclave