Un ensayo de opsonoadherencia para evaluar la opsonización de bacterias encapsuladas por anticuerpos anticápsulas

Resumen

Fuente: Chua, J., et al. Ensayo de adherencia al Opsono-Ensayo para evaluar anticuerpos funcionales en el desarrollo de vacunas contra Bacillus anthracis y otros patógenos encapsulados. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo muestra un ensayo de opsonoadherencia para examinar la interacción entre las bacterias opsonizadas y las células inmunitarias. Las bacterias marcadas con fluorescencia, tratadas con suero de prueba que contiene anticuerpos anticápsulas, se incuban con macrófagos. Después de teñir los macrófagos con fluorescencia, las bacterias adheridas a la superficie del macrófago se observan bajo un microscopio para su visualización.

Protocolo

1. Cultivo y preparaciones bacterianas

NOTA: La especie bacteriana utilizada en este protocolo es una cepa virulenta encapsulada, B. anthracis Ames. Todas las manipulaciones con esta especie requieren autorizaciones de bioseguridad y protección apropiadas y deben realizarse en un gabinete de seguridad biológica de Clase II o Clase III ubicado en un laboratorio BSL-3. Siga los procedimientos operativos institucionales para el trabajo BSL-3 y para el uso de equipo de protección personal al manipular bacterias.

1. Prepare el caldo Brain Heart Infusion (BHI) disolviendo 37 g de BHI en polvo en 1 L de agua y esterilizándolo en autoclave a 121 °C durante 15 min. Almacene el caldo a temperatura ambiente.
2. Prepare la solución de bicarbonato de sodio al 8% en agua y esterilícela con una jeringa de filtro de 0,20 μm. Almacene la solución a 4 °C y utilícela dentro de 1 día.
3. Mezcle 8 g de caldo de nutrientes, 3 g de extracto de levadura y 15 g de agar en 1 l de agua para preparar placas de agar NBY. Autoclave a 121 °C durante 15 min. Vierta en placas de Petri y deje que se solidifique. Almacene los platos a 4 °C.
   nota: Las placas de agar NBY pueden fabricarse con o sin bicarbonato de sodio. La adición de bicarbonato de sodio al caldo y a las placas de agar induce el crecimiento de colonias mucoides formadas por bacilos encapsulados. La concentración final de bicarbonato de sodio tanto en medios líquidos como sólidos es del 0,8%.
4. Prepare el caldo de cultivo para B. anthracis mezclando 50% de caldo BHI esterilizado en autoclave, 40% de FBS y 10% de solución de bicarbonato de sodio (v/v).
   nota: Este caldo está formulado para producir cadenas cortas de bacilos encapsulados.
5. Prepare una placa maestra de B. anthracis rayándola para aislarla en una placa de agar NBY de un caldo de esporas un día antes de cultivarla en caldo. Incubar a 37 °C.
6. Inocular 30 mL de caldo de cultivo en un matraz ventilado de 250 mL con varias colonias de B. anthracis.
   nota: Se necesita una proporción específica de volumen a superficie de caldo, como se especifica aquí, para producir bacilos encapsulados al máximo.
7. Agitar el cultivo de caldo a 125 rpm, 37 °C con 20% de CO₂ y humedad durante 18–24 h.
   nota: El cultivo de B. anthracis a temperaturas superiores a 37 °C puede inhibir la producción de cápsulas.
8. Utilice la tinción negativa con tinta china para asegurar una encapsulación suficiente y que los bacilos estén en cadenas cortas (1-5 bacilos/cadena) antes de la fijación (ver sección 2).
9. Para determinar las unidades formadoras de colonias (UFC), diluya en serie 100 μL de cultivo 1:10 en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y diluciones de cultivo en placa en placas de agar sangre de oveja. Incubar durante 12-18 h a 37 °C. Contar las UFC y determinar el número de bacterias por mL de cultivo.
   nota: El recuento también se puede realizar con un hemocitómetro bajo el microscopio una vez que las bacterias se han fijado. Sin embargo, esto no se recomienda porque los bacilos son difíciles de ver con un aumento bajo.
10. Añadir un 16% de paraformaldehído (PF) a todo el volumen de cultivo bacteriano a una concentración final del 4% de PF para fijar los bacilos. Agite lentamente en una coctelera a temperatura ambiente durante 7 días.
    nota: Siete días de incubación en PF al 4% se basan en el procedimiento operativo estándar institucional del Instituto de Investigación Médica de Enfermedades Infecciosas del Ejército de los Estados Unidos (USAMRIID) para la fijación de bacilos vegetativos.
11. Para eliminar el fijador y comprobar la esterilidad, lavar tres veces 4 mL (10% de volumen) de suspensión bacteriana fija en un tubo cónico de 50 mL por centrifugación a ≥3000 x g durante 45 min y utilizar 30 mL/lavado con PBS. Almacene la muestra restante en PF al 4% a 4 °C.
    nota: Después de la granulación, el gránulo bacteriano es esponjoso debido a la presencia de una cápsula. Tenga cuidado de no alterar el pellet durante el lavado. Es necesario retirar todo el fijador para que no interfiera con las pruebas de viabilidad. Si es necesario, aumente el número de lavados.
12. Para las pruebas de viabilidad, inocular 40 ml de un medio de crecimiento bacteriano (por ejemplo, caldo BHI) con 4 ml de suspensión lavada (≤ 10% del volumen de caldo) e incubar a 37 °C durante 7 días. Compruebe la densidad óptica a 600 nm antes y después de 7 días para medir la turbidez.
13. Después de 7 días de incubación en caldo de cultivo, coloque ≥100 μL de caldo en una placa de agar e incube durante otros 7 días. Si no se observa un aumento en la turbidez y no hay crecimiento en las placas, el cultivo original se considera estéril y puede transferirse a un laboratorio BSL-2.
    NOTA: El Programa Federal de Agentes Selectos exige que B. anthracis inactivada solo pueda transferirse de los laboratorios BSL-3 después de demostrar la esterilidad completa de la muestra. Las pruebas de viabilidad para B. anthracis inactivada consisten en el cultivo del 10% de la muestra en caldo durante 7 días, seguido de un cultivo en un medio sólido durante otros 7 días. Siga las pautas institucionales para recibir la aprobación de la transferencia una vez que se establezca la esterilidad.         

>2. Tinción negativa y microscopía óptica para observar la encapsulación y las cadenas de bacilos

1. Mezcle 5 μL de suspensión bacteriana con 2 μL de tinta china en un portaobjetos de microscopio. Coloque un cubreobjetos de 1 o 1,5 μm de espesor encima de la suspensión sin crear burbujas.
   nota: Se puede usar esmalte de uñas para sellar el vidrio de la cubierta en el portaobjetos.
2. Observe la suspensión bacteriana usando una lente de objetivo de aceite de 40x a 100x en un microscopio óptico. Asegúrese de que los bacilos estén encapsulados observando una zona de aclaramiento (la cápsula excluye la tinta china) que rodea a cada bacteria y que las cadenas de los bacilos sean cortas.

>3. Marcaje FITC de bacterias

1. Disolver el isotiocianato de fluoresceína (FITC) en dimetilsulfóxido a una concentración de 2 mg/mL.
2. Mida el volumen de stock de bacterias inactivadas.
3. Lave la culata 3 veces en PBS para quitar el fijador.
4. Añadir solución de FITC a una concentración final de 75 μg/mL. Agite lentamente la mezcla durante 18-24 h a 4 °C.
5. Lave tres veces las bacterias granulando a ≥3000 x g, 45 min, y usando 30 mL PBS/lavado para eliminar el exceso de FITC. Asegúrese de que el pellet esponjoso no se altere durante el lavado. Vuelva a suspender los bacilos en PBS al mismo volumen de inicio.
6. Alícuota y almacene los bacilos en microtubos a -20 °C hasta su uso. No congele/descongele los bacilos varias veces, ya que los bacilos pueden perder su cápsula.

>4. Opsonización bacteriana

1. Inactivar por calor un pequeño volumen de sueros de prueba (de primates no humanos, NHP) a 56 °C durante 30 min en un bloque de calor.
2. Descongele y lave las bacterias marcadas con FITC con PBS 2x granulando a 15000 x g durante 3-5 min. Vuelva a suspender en PBS al mismo volumen inicial.
3. En una placa inferior redonda de 96 pocillos (placa #2), diluya en serie los sueros de prueba en medio celular. En otra placa inferior redonda de 96 pocillos (placa #3), agregue 10 μL de suero de prueba diluido en cada pocillo.
   nota: En todas las placas, se incluyeron PBS y sueros de mono normales en lugar de sueros de prueba diluidos como controles negativos. También elegimos un suero de prueba como control positivo para generar una curva estándar para normalizar todos los ensayos realizados en diferentes días. El suero de la prueba de control positivo se eligió arbitrariamente porque era abundante.
4. Al plato #3, agregue 10 μL de complemento de conejo bebé recién reconstituido.
   nota: Una vez reconstituido, deseche el complemento de conejo bebé restante; No vuelva a congelar ni descongelar.
5. A la placa #3, agregue el volumen apropiado de bacilos marcados con FITC para una multiplicidad de infección de 1:20. Por ejemplo, agregue el volumen que contiene 5 x 10⁴ x 20 bacilos para 5 x 10⁴ celdas. Llene cada pocillo en la placa # 3 con el volumen apropiado de medio celular hasta un total de 105 μL.
   nota: La placa #1, que contiene células, recibe 100 μL de bacterias opsonizadas y los 5 μL restantes como volumen vacío. Probamos cada dilución de los sueros de prueba por duplicado.
6. Incubar la placa #3 a 37 °C durante 30 min en presencia de 5% de CO₂ con humedad para opsonizar los bacilos.

>5.Ensayo de adherencia y marcaje fluorescente de células de mamíferos

1. Mantenga todos los reactivos a 37 °C antes de su uso.
2. Coloque la placa # 1, que contiene las células adherentes, en un bloque de calor a 37 ° C.
3. Utilice una pipeta multicanal para eliminar el medio gastado de los pocillos y reemplácelo rápidamente con 100 μL de bacterias opsonizadas de la placa # 3. Asegúrese de que no se hayan generado burbujas en los pocillos durante el pipeteo. Incubar la placa #1 a 37 °C con 5% de CO₂ y humedad durante 30 min para la adherencia.
4. Lave cada pocillo 5 veces con 150 μL de PBS sobre un bloque de calor a 37 °C para eliminar los bacilos sueltos.
   nota: Se debe tener cuidado para asegurarse de que las células no se dispersen accidentalmente durante el lavado.
5. Diluya 16% de PF con PBS 1:4 para obtener 4% de PF. Fije las celdas con 4% de PF durante 1 h añadiendo 150 μL a cada pocillo. Lave las celdas 2 veces con PBS.
6. Mezcle 2 μL de HCS (cribado de alto contenido) Orange Cell Stain en 10 mL de PBS. Añadir 150 μL de esta solución de tinción a las células fijas e incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
7. Lave los pozos 2 veces con PBS.
8. Almacenar a 4 °C hasta la microscopía.

6. Microscopía

NOTA: En general, un microscopio de fluorescencia automatizado de alto rendimiento facilitará la obtención de imágenes para el OAA. Si no se dispone de un sistema automatizado, se pueden tomar manualmente imágenes fluorescentes de los bacilos adherentes. En este estudio, se obtuvieron imágenes de bacilos adherentes y monocapas celulares utilizando el sistema de microscopía de escaneo láser Zeiss 700 con equipo especializado; nuestro sistema estaba compuesto por el microscopio invertido Zeiss Axio Observer Z1 equipado con una platina automatizada, el módulo Definite Focus, 40 objetivos NA 0.6, cámara Axio Cam HRc y el software Zen 2012 (Blue Edition). Las imágenes adquiridas son imágenes de campo amplio, no confocales. El siguiente protocolo está pensado como una configuración básica de microscopio que es aplicable a una variedad de sistemas de microscopía automatizados.

1. Incubar la placa #1 a temperatura ambiente durante 30 min. Encienda el microscopio y el equipo relacionado.
   nota: La aclimatación a temperatura ambiente evita que se forme condensación en la placa de vidrio durante la toma de imágenes. Además, evita el desenfoque debido a los cambios de temperatura.
2. Coloque la placa en el escenario y enfoque las celdas utilizando un campo claro o un contraste de fase.
3. Seleccione Formato de 96 pocillos como configuración de la placa. Seleccione la configuración del canal.
   nota: La excitación máxima y la longitud de onda de emisión de FITC son 495/519 nm; las tinciones de células naranjas HCS son de 556 y 572 nm. Se pueden utilizar otros fluoróforos dependiendo de los filtros disponibles en el microscopio.
4. Seleccione la configuración en Modo de mosaico. Indique el número de imágenes a adquirir.
   nota: La función de mosaico permite la captura de múltiples ubicaciones en un pozo de muestra y se puede configurar para adquirir una imagen en un mosaico o en un formato aleatorio. Tomamos imágenes de 10 áreas aleatorias por pozo.
5. Cambie el modo de adquisición a "blanco y negro" o "monocromo" y agrupe ≥ 2x2.
   nota: Establecer el agrupamiento de 1x1 a 2x2 o 4x4 aumentaría la velocidad de la microscopía, pero también daría como resultado una resolución más baja de la imagen. En el caso de la OAA, basta con utilizar estos ajustes, ya que el ensayo enumera tanto los macrófagos como las bacterias adherentes.
6. Encienda el enfoque automático o el módulo de enfoque. Indica la frecuencia con la que se debe realizar la función de enfoque automático. Active la función de pila Z, si está disponible. Indique el número de pilas Z que capturarán el espesor de la monocapa celular y los bacilos adherentes.
   nota: El número de pilas Z elegidas aumentará el tiempo de microscopía, pero garantizará que se tome una imagen con el enfoque correcto en cada pila Z.
7. Designe una carpeta de archivos para guardar las imágenes. Ejecute el programa automatizado de imágenes.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Filtro de jeringa de 0,20 μm (25 mm, celulosa regenerada)	Corning, Corning, NY	431222
Jeringa de 10 ml (punta Luer-Lock)	BD, Franklin Lakes, Nueva Jersey	302995
Placas negras de 15μ 96 pocillos (placa #1 para imágenes)	In Vitro Scientific, Sunnyvale, CA	P96-1-N
16% paraformaldehído	Ciencia de la microscopía electrónica, Hatfield, PA	15710
Matraz tratado con cultivo de tejidos de 75 cm	Corning, Corning, NY	430641
Agar (polvo)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	A1296
Complemento Baby Rabbit	Laboratorios Cedarlane, Burlington, Carolina del Norte	CL3441
Extracto de levadura Bacto	BD, Sparks, MD	288620
BBL Infusión Cerebro-Corazón (BHI)	BD, Sparks, MD	211059
Placas de agar sangre (TSA con sangre de oveja)	Remel, Lenexa, KS	R01198
Raspador de células	Sarstedt, Newton, Carolina del Norte	83.183
Placas de cultivo celular Costar de 96 pocillos (placas #2 y 3 para diluciones)	Corning, Corning, NY	3596
Cubreobjetos	Ciencia de la microscopía electrónica, Hatfield, PA	72200-10
Caldo de nutrientes Difco	BD, Sparks, MD	234000
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), alto contenido de glucosa	Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	11965-092	Contiene 4500 mg/L de glucosa, 4 mM de L-glutamina, rojo de fenol
Sistema de imagen de células automáticas EVOS FL (microscopio de fluorescencia)	Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	AMAFD1000
Suero Fetal Bovino	Hyclone, GE Healthcare Ciencias de la Vida, South Logan, UT	SH30071.03	No irradiado con rayos gamma, no inactivado por calor
Isotiocianato de fluoresceína	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	F143
HCS Cell Mask Tinción de células naranjas	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	H32713
hemocitómetro (Neubauer mejorado)	Hausser Scientific, Horsham, PA	3900
Solución de tinta china	BD, Sparks, MD	261194
L-glutamina (200 mM)	Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham MA	25030081	Suplementar el medio con 2 mM de L-glutamina adicional
Nikon Eclipse TE2000-U (microscopio compuesto invertido)	Instrumentos Nikon, Melville, NY	TE2000
PBS sin Calcio ni Magnesio	Lonza, Walkersville, MD	17-516F
Solución de penicilina-estreptomicina, 100x	Hyclone, GE Healthcare Ciencias de la Vida, South Logan, UT	SV30010
Placas de Petri (100 x 15 mm)	Halcón, Corning, Durham, Carolina del Norte	351029	Para placas de agar
Línea celular de macrófagos RAW 264.7 (Tib47)	ATCC, Manassas, VA	ATCC TIB-71
Diapositivas	VWR, Radnor, PA	16004-422
Bicarbonato de sodio	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	S5761
Solución de Azul de Tripano (0.4%)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	T8154
Microscopía láser de barrido Zeiss 700 (microscopio confocal)	Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, NY	4.109E+15