Evaluación de la activación controlada de células T con un péptido fotoactivable MHC

Resumen

Fuente: Sanchez, E., et al. Control espacial y temporal de la activación de las células T mediante un agonista fotoactivable. J. Vis. Exp. (134), (2018)

Este video muestra un método para desengrasar un complejo de histocompatibilidad de péptido mayor fotoactivable utilizando irradiación UV. El proceso de decaging expone la secuencia de péptidos nativos, lo que permite una activación precisa de las células T.

Protocolo

1. Preparación de superficies de vidrio estimuladoras

1. Cubra el cubreobjetos de ocho pocillos con poli-L-lisina biotinilada (Bio-PLL) diluida 1:500 en agua destilada y desionizada (ddH₂O). Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT).
2. Lavar con H₂O.
3. Secar durante 2 h a RT.
4. Bloquee las superficies recubiertas con Bio-PLL con tampón de bloqueo (solución salina tamponada con HEPES [10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl], con 2% de BSA) durante 30 min en RT.
   1. Disolver 5 mg de hidrobromuro de poli-L-lisina en 1 mL de NaPO4 de 10 mM, pH 8,5.
   2. Añadir 125 μmol (0,55 mg) de biotina NHS (de un stock de 100 mg/mL en DMSO) y comprobar el pH de la reacción. Si el pH está por debajo de 8,5, agregue 2 μL de 4 N NaOH para elevarlo a entre pH 8,5 y 9,5.
   3. Vórtice durante 30 min.
   4. Apague la reacción con 50 μL de glicina 100 mM disuelta en 20 mM Tris pH 8.0.
   5. Girar a máxima potencia durante 10 min y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo.
      NOTA: La calidad de Bio-PLL generalmente se compara con preparaciones anteriores mediante el recubrimiento de diluciones dobles en serie del material en una placa ELISA de 96 pocillos y la cuantificación del contenido de biotina después de la incubación con estreptavidina acoplada a fosfatasa alcalina.
5. Retire el búfer de bloqueo. No permita que los pozos se sequen. Añadir estreptavidina (100 μg/mL en tampón de bloqueo). Incubar durante 1 h a 4 °C.
6. Lavar en HBS. Llene e invierta los pozos deslizantes de la cámara de 4 a 5 veces, eliminando el HBS de los pocillos. No permita que los pozos se sequen.
7. Agregue los ligandos de pMHC biotinilados y las moléculas de adhesión a la superficie.
   nota: El CCM y el OVA se pueden fotoenjaular mediante la adición de grupos protectores basados en orto-nitrobencillo (p. ej., nitrofeniletilo (NPE) o nitroveratryloxycarbonil (NVOC)) al grupo ε-amino de las lisinas clave (K12 en el MCC, K7 en OVA). El MCC y el OVA fotocodificados se pueden obtener de proveedores comerciales. Después de la reconstitución en tampón acuoso, se vuelven a plegar en I-E^k y H2-K^b expresados bacterianamente utilizando enfoques establecidos.
8. Validación de péptido MCC u OVA fotoactivable
   1. Elimine los péptidos protegidos contra NVOC mediante la irradiación UV con una lámpara UV de mano (consulte la tabla de materiales) durante 20 minutos en RT.
   2. Pulse 1,0 x 10⁵ APC con 1 μM de péptido no estimulador (control negativo, p. ej., Hb), péptido fotoactivable no irradiado, péptido fotoactivable irradiado y péptido agonista (control positivo, p. ej., CCM) durante 1 h hasta toda la noche a 37 °C.
   3. Para estimular las células T que expresan la 5C. C7/2B4/Y TCR, utilice pilas B CH12 o CH27. Para estimular las células T OT1, use células de timoma RMA-s o EL4.
   4. Mezcle las APC pulsadas con un número igual de células T en placas inferiores redondas de 96 pocillos a un volumen final de 200 μL. Incubar a 37 °C durante 12 a 24 h.
   5. Recuperar los sobrenadantes de cada pocillo y analizar IL-2 por ELISA con detección colorimétrica de estreptavidina-peroxidasa de rábano picante.
      NOTA: Se recomienda encarecidamente confirmar el estado de enjaulamiento de todos los péptidos mediante espectrometría de masas por electrospray antes de volver a plegarlos en complejos MHC.
9. Realizar el plegamiento y purificación del MHC para minimizar la exposición a la luz. Por ejemplo, envuelva las reacciones de plegamiento en papel de aluminio y realice una cromatografía de filtración en gel con la lámpara UV apagada.
   nota: Se ha encontrado que los fotoactivables MCC-I-E^k y OVA-H2-K^b inducen la activación de células T independientes de los rayos UV a alta densidad, posiblemente debido a un enjaulamiento funcional incompleto. Por lo tanto, el pMHC fotoactivable se diluye en un exceso de 10 a 30 veces de pMHC no estimulador (por ejemplo, I-E^k que contiene el péptido de hemoglobina (Hb)) durante la etapa de inmovilización. Esto mejora la relación señal-ruido del experimento de imagen posterior.
10. Para fotoactivar las células T CD4⁺, utilice colectivamente una mezcla de Hb-I-Ek biotinilada (3 μg/mL), MCC-I-E^k fotoactivable biotinilado (0,1 μg/mL) y anticuerpo biotinilado contra el MHC de clase I H2-K^k (0,5 μg/mL). El anticuerpo anti-H2-K^k estimula el 5C. Las células C7/2B4/Y T, que expresan H2-K^k, se propagan sobre la superficie del vidrio sin sufrir activación.
11. En el caso de los linfocitos T CD8⁺, utilice una mezcla de H2-Db biotinilado que contenga el péptido KAVYDFATL (1 μg/mL), OVA-H2-Kb fotoactivable biotinilado (0,1 μg/mL) y el dominio extracelular de la molécula de adhesión ICAM-1 (2 μg/mL producido por cultivo de células de insectos). El ICAM-1 fomenta la formación de contacto cercano al involucrar la integrina LFA1 en la superficie de la célula T.
12. Aplicar todas las mezclas de proteínas en tampón de bloqueo, seguido de una incubación durante 1 h a RT o al menos 2 h a 4 °C.
    nota: Se ha determinado previamente que la densidad molecular en superficies de este tipo es de ~8000 por μm2. Dado que el pMHC fotoactivable representa ~1/30 de la proteína biotinilada en la superficie, su densidad será de ~267 moléculas por μm2, antes de la decaducidad.
13. Lavar como en el paso 1.6 y dejar en HBS hasta que esté listo para usar.
14. Agregue 200,000 células T CD4⁺ o CD8⁺ que expresen el TCR apropiado en cada pocillo y permita que las células se adhieran a 37 °C durante 15 min. Una vez que las células se han adherido y diseminado en la superficie, están listas para la fotoactivación y la obtención de imágenes.
    nota: La transducción retroviral de linfocitos T efectores con sondas de imagen fluorescentes se describe en detalle en otra parte. La señalización del calcio también se puede estudiar utilizando células T no transducidas cargadas con el colorante sensible al calcio Fluo-46. El colorante radiométrico Fura-2 no se recomienda porque requiere excitación en el rango UV, lo que también induce la disminución del pMHC fotoactivable.

>2. Adquisición de imágenes

1. Utilice un microscopio TIRF invertido equipado con una lente de objetivo 150X compatible con UV para la adquisición de imágenes. Irradia UV regiones definidas por el usuario utilizando un sistema de diafragma digital conectado a una lámpara de mercurio (HBO) de 100 W. Dirija la luz ultravioleta de esta lámpara a la muestra utilizando un espejo de paso largo de 400 nm.
2. Utilice software de análisis de imágenes para la fotoactivación localizada y la adquisición de lapsos de tiempo. En la mayoría de los experimentos, monitoree las sondas en los canales verde y rojo utilizando láseres de excitación de 488 nm y 561 nm, respectivamente. La luz láser se dirige a la muestra mediante un espejo dicroico de paso de doble banda que también transmite en el rango UV (para permitir la degradación). Consulte la Tabla de Materiales y la Figura 1 para obtener información adicional sobre la configuración del microscopio.
3. Después de montar el portaobjetos de la cámara que contiene las células T, ajuste la configuración para obtener la iluminación TIRF o de epifluorescencia, según sea necesario. En el modo en vivo, seleccione un campo de celdas que expresen las sondas fluorescentes de interés. Establezca regiones a escala micrométrica para la fotoactivación debajo de células individuales mediante el control de software.
4. Comience la adquisición de lapso de tiempo. Normalmente, se adquieren 80 puntos de tiempo, con un intervalo de 5 s entre cada punto de tiempo. Esto deja tiempo más que suficiente para exposiciones secuenciales de 488 nm y 563 nm, en el caso de experimentos de doble color.
5. Después de 10 puntos de tiempo, fotoactive las regiones seleccionadas abriendo el obturador de diafragma digital durante 1 - 1,5 s.
6. Una vez completado el lapso de tiempo, seleccione un nuevo campo de celdas y repita el proceso.

Resultados

Figura 1: Configuración del microscopio para fotoactivación e imágenes TIRF.

Los láseres de 488 nm y 561 nm se utilizan para la obtención de imágenes TIRF y de epifluorescencia de sondas verdes y rojas, respectivamente. La luz ultravioleta para la fotoactivación se toma de una lámpara de mercurio (Hg) conectada a un sistema de diafragma digital capaz de iluminar regiones p...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nunc Lab-Tek Cubreobjetos con cámara	Thermofischer Scientific	155361
Hidrobromuro de poli-L-lisina	Sigma-Aldrich	Página 2636	Necesitará hacer poli-L-lisina biotinilada
EZ-Link NHS-Biotina	Thermofischer Scientific	20217	Necesitará hacer poli-L-lisina biotinilada
Estreptavidina	Thermofischer Scientific	434301
BirA-500: Kit de reacción estándar de biotina-proteína ligasa BirA	avidez	BirA500	Se utilizará para biotinilar proteínas
Hb I-EK biotinilado			Para el plegamiento de proteínas, consulte la referencia 6. Para la biotinilación, utilice el kit BirA
NPE-MCC I-EK biotinilado	Anaspec		El NPE-MCC PERSONALIZADO (HANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATKOH) se puede comprar en Anaspec
Anticuerpo αH2-Kk biotinilado	BD Biociencias	553591
NPE-OVA biotinilado H2-Kb	Anaspec		NPE-OVA (H-SIINFE- K(Nvoc)-L-OH) se puede comprar en Anaspec
KAVY H2-DB biotinilado	Anaspec		La proteína sintetizada personalizada (KAVYDFATL) se puede comprar en Anaspec
ICAM1 biotinilado			Para el plegamiento de proteínas, consulte la referencia en el protocolo. Para la biotinilación, utilice el kit BirA
Lámpara UV de mano	UVP	UVGL-25	La lámpara se mantiene a < 1 cm de la muestra. 30 s de luz 365 son suficientes para el decaje detectable, 20 min para el decaje cuantitativo.
Sistema Olympus IX-81 OMAC TIRF.	Olimpo		En la Figura 6 se puede encontrar información adicional sobre el sistema de imágenes
Diafragma digital de mosaico	Andor
Software de libro de diapositivas	Innovaciones en imágenes inteligentes