Evaluación de la topología de la sinapsis inmunológica a través de imágenes de células vivas

Resumen

Fuente: Martinelli, R. et al., Un modelo de células planas endoteliales para obtener imágenes de la dinámica de sinapsis inmunológica.J. Vis. Exp. (2015)

Este video muestra imágenes de células vivas de la topología inmunológica de la sinapsis, investigando las interacciones entre los linfocitos T y las células epiteliales portadoras de antígenos fluorescentes. La microscopía de fluorescencia revela un desplazamiento rojo del citoplasma y anillos amarillos en la membrana de las células endoteliales, lo que indica la formación de sinapsis inmunológicas.

Protocolo

1. Preparación de linfocitos T efectores/de memoria CD4⁺ Th1 humanos

1. Aplique un torniquete en el brazo del donante, limpie la vena con alcohol e inserte una aguja. Extraiga lentamente 15 ml de sangre en un vacutainer utilizando EDTA como anticoagulante. Cuando se haya extraído la sangre, desate el torniquete antes de retirar la aguja. Aplique presión inmediatamente sobre la herida con una gasa estéril cuando se retire la aguja.
2. Transfiera la sangre a un tubo de 50 ml. Añadir RPMI-1640 en RT a una dilución 1:1 (volumen final 30 ml). Superponga cuidadosamente la sangre diluida en dos tubos de 50 ml que contengan 15 ml de....

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Torniquete sin látex elástico BD Vacutainer	BD Biociencias	367203
Hisopos con alcohol BD	BD Biociencias	326895
BD Vacutainer Safety-Lok	BD Biociencias	367861	K2 EDTA
BD Vacutainer Juego de Extracción de Sangre con Botón Pulsador	BD Biociencias	367335
RPMI-1640	Sigma-Aldrich	R8758-1L
Ficoll-Paque	Sigma-Aldrich	GE17-1440-02	Llevar a RT antes de usar
FCS-Optima	Productos biológicos de Atlanta	S12450	Calor inactivado
Penicilina-Estreptomicina	Sigma-Aldrich	P4458-100ML
Azul de tripano	Sigma-Aldrich	T8154-20ML
Enterotoxina estafilocócica B	Tecnología de toxinas	BT202RED	Solución madre 1mg/ml en PBS
Síndrome de shock tóxico toxina 1	Tecnología de toxinas	TT606RED	Solución madre 1mg/ml en PBS
IL-15 humana	Sistemas de investigación y desarrollo	247-IL-025	Solución madre 50ug/ml en PBS
Pbs	Tecnologías de la Vida	10010-049
Fibronectina	Tecnologías de la Vida	33016-015	Solución madre 1mg/ml en H20
HMVEC-d Ad-Dermal MV Endo Células	Lonza	CC-2543	pueden utilizar otras CE microvasculares humanas, es decir, HLMVEC
Kit de balas EGM-2 MV	Lonza	CC-3202
Tripsina-EDTA	Sigma-Aldrich	T-4174	Solución madre 10x, diluida en PBS
Kit de nucleofactor Amaxa-HMVEC-L	Lonza	VPB1003	Kit necesario para el paso 4
IFN-g	Sigma-Aldrich	I3265	Solución madre 1mg/ml en H20
TNF-alfa 10ug, humano	Tecnologías de la Vida	PHC3015	Solución madre 1mg/ml en H20
Fenol Rojo sin HBSS	Tecnologías de la Vida	14175-103
Hepes	Fisher Científico	BP299-100
Cloruro de calcio	Sigma-Aldrich	C1016-100G	Solución madre 1M en H20
Cloruro de magnesio	Sigma-Aldrich	208337	Solución madre 1M en H20
Albúmina sérica humana	Sigma-Aldrich	A6909-10ml
Immersol 518 F Aceite de inmersión sin fluorescencia	Fisher Científico	12-624-66A
Fura-2 AM 20x50ug	Tecnologías de la Vida	F1221	Solución madre 1mM en DMSO
pEYFP-Mem (Mem-YFP)	Clontech	6917-1
Monómero pDsRed (DsRed citoplasmático soluble)	Clontech	632466
Membrana de monómero pDsRed (Mem-DsRed)	Clontech	632512
pEGFP-actina	Clontech	6116-1
Alexa Fluor 488 Faloidina	Tecnologías de la Vida	A12379
Tubos de centrífuga cónicos Falcon 15mL	Fisher Científico	14-959-70C
Tubos de centrífuga cónicos Falcon 50mL	Fisher Científico	14-959-49A
Matraces tratados para cultivo de tejidos Falcon T25	Fisher Científico	10-126-9
Matraces tratados para cultivo de tejidos Falcon T75	Fisher Científico	13-680-65
Cultivo celular de Corning T175 tratado	Fisher Científico	10-126-61
Cubreobjetos de vidrio	Fisher Científico	12-545-85	12 mm de diámetro
Placas de cultivo de tejidos Falcon de 24 pocillos	Fisher Científico	08-772-1
Placas Delta-T	Bioptechs	04200415B
Pipetas desechables Pasteur Wheaton	Fisher Científico	13-678-8D
Tubo Eppendorf de 1,5 ml	Fisher Científico	05-402-25
ICAM1 ratón anti-humano	BD Biociencias	555509
Ratón HS1 anti-humano	BD Biociencias	610541
Anti-humano CD11a (LFA-1alpha) Purificado	ebiociencia	BMS102
Anti-humano CD3 Alexa Fluor® 488	ebiociencia	53-0037-41
Anticuerpo anti-MHC de clase II	Abcam	AB55152
Anticuerpo anti-Talin 1	Abcam	AB71333
Anticuerpo anti-PKC theta	Abcam	AB109481
Fosfotirosina (4G10 Platino)	Millipore	50-171-463
Nucleofector II	Amaxa Biosystems		Electroporador requerido para el paso 4
Zeiss Axiovert	Carl Zeiss MicroImaging
Zeiss LSM510	Carl Zeiss MicroImaging
Software Zeiss Axiovison	Carl Zeiss MicroImaging
NU-425 (Serie 60) Cabina de Seguridad Biológica	NuAIRE	Nu-425-600
Forma STRCYCLE 37 °C, 5% CO2 Incubadora de cultivo celular	Fisher Científico	202370
centrífuga 5810	Eppendorf	EW-02570-02
Hemotómetro	Sigma-Aldrich	Z359629	Hemocitómetro Bright-Line
Baño de agua Isotemp modelo 202	Fisher Científico	15-462-2