Evaluación de la topología de la sinapsis inmunológica a través de imágenes de células vivas

Resumen

Fuente: Martinelli, R. et al., Un modelo de células planas endoteliales para obtener imágenes de la dinámica de sinapsis inmunológica.J. Vis. Exp. (2015)

Este video muestra imágenes de células vivas de la topología inmunológica de la sinapsis, investigando las interacciones entre los linfocitos T y las células epiteliales portadoras de antígenos fluorescentes. La microscopía de fluorescencia revela un desplazamiento rojo del citoplasma y anillos amarillos en la membrana de las células endoteliales, lo que indica la formación de sinapsis inmunológicas.

Protocolo

1. Preparación de linfocitos T efectores/de memoria CD4⁺ Th1 humanos

1. Aplique un torniquete en el brazo del donante, limpie la vena con alcohol e inserte una aguja. Extraiga lentamente 15 ml de sangre en un vacutainer utilizando EDTA como anticoagulante. Cuando se haya extraído la sangre, desate el torniquete antes de retirar la aguja. Aplique presión inmediatamente sobre la herida con una gasa estéril cuando se retire la aguja.
2. Transfiera la sangre a un tubo de 50 ml. Añadir RPMI-1640 en RT a una dilución 1:1 (volumen final 30 ml). Superponga cuidadosamente la sangre diluida en dos tubos de 50 ml que contengan 15 ml de medio de aislamiento de linfocitos prefiltrado, como Ficoll-Paque at RT.
3. Centrifugar el gradiente a RT durante 30 min a 1.200 x g en un rotor de cangilón oscilante. Durante la centrifugación, prepare el medio de células T (500 ml de RPMI-1640, 50 ml de FCS, 5 ml de penicilina/estreptomicina).
4. Al retirar el tubo de 50 ml de la centrífuga, observe cuatro capas: una bolita de glóbulos rojos en la parte inferior, el paco, una capa de células que contiene glóbulos blancos (incluidos los linfocitos) y el plasma. Retire con cuidado la capa de glóbulos blancos con una pipeta Pasteur y transfiérela a un tubo Falcon de 50 ml.
5. Lave la capa de glóbulos blancos añadiendo RT RPMI-1460 (hasta 20 ml) y centrifugando a RT durante 5 min a 1.200 x g. Vuelva a suspender los glóbulos blancos en 1 ml de medio de células T. Añada 5 μl de la suspensión celular de 1 ml a 250 μl de medio de células T en un tubo de centrífuga de 1,5 ml y mezcle suavemente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta.
6. Añadir 25 μl de suspensión celular diluida a 25 μl de azul de tripán al 0,4%. Agregue 10 μl de mezcla a cada lado de un hemocitómetro estándar.
7. Coloque el hemocitómetro en un microscopio óptico de baja potencia. Usando un objetivo 10X, cuente el número de células vivas que han excluido el tinte azul de tripán y están presentes en el cuadrado central de ambos lados del hemocitómetro.
8. Para calcular la concentración de células, multiplique el promedio de los 2 cuadrados por 100 (factor de dilución) y luego multiplíquelo por 10⁴ para obtener el número de células/ml.
9. Ajustar la concentración final a 0,5 x 10⁶ células/ml en medio de células T. Añadir a las células una concentración final de 1 μg/ml de superantígenos bacterianos enterotoxina estafilocócica B (SEB) y toxina 1 del síndrome de shock tóxico (TSST). Cultivo durante 72 horas (37 °C y 5% de CO₂) para ampliar la población de linfocitos T CD4⁺.
10. Granular células T (1.200 x g, 5 min) y resuspender a 0,5 x 10⁶ células/ml en medio de células T con la adición de IL-15 humana (20 ng/ml). Transfiera los linfocitos a un matraz T150. Continúe expandiendo/dividiendo las celdas en medio completo-IL-15 cada 24-48 horas según sea necesario (según el color del medio; es decir, cada vez que los medios cambian de rosa a ligeramente amarillo) a partir de entonces. Mantener la población de linfocitos resultante hasta por 15 días.
    nota: Por diseño, este protocolo activará y expandirá específicamente un subconjunto de células T CD4⁺ que son reactivas a SEB y TSST y luego las conducirá hacia un fenotipo efector/de memoria similar a Th1. Otros glóbulos blancos no sobreviven ni crecen en estas condiciones, de modo que en el paso 1.10 las células serán al menos un 95% de células T CD4⁺, CD45RO⁺, como se puede evaluar fácilmente mediante citometría de flujo. Si se desea, se puede lograr fácilmente una mayor purificación a través de kits de selección positiva o negativa basados en anticuerpos/perlas magnéticas disponibles en el mercado.

>2. Inicio del cultivo primario de células endoteliales humanas

1. Recubrir un matraz T25 con fibronectina (FN) 20 μg/ml en PBS en condiciones estériles. Dejar en RT durante 30-60 min. Retirar FN y añadir 5 ml de medio completo (medio basal endotelial (EBM-2) suplementado con medio de crecimiento endotelial (EGM-2) singlequots). Preincubar en una incubadora de cultivos celulares a 37 °C durante al menos 30 min.
2. Descongele un vial de pulmón humano congelado o células endoteliales microvasculares dérmicas (HLMVEC o HDMVEC) en un baño de agua a 37 °C con agitación suave ocasional durante ~ 2-3 min. Transfiera inmediatamente las células al matraz T25 que contiene medios precalentados. Agite suavemente y colóquelo en una incubadora a 37 ° C.
3. Cambie el medio después de ~4-6 hr. Continúe cambiando el medio aproximadamente cada 48 h (o cuando el medio se vuelva ligeramente amarillo) hasta que la placa alcance ~90-95% de confluencia.

>3. División y expansión general de las células endoteliales

1. Cultive células hasta ~90-95 de confluencia. Esto puede tardar de 2 a 5 días. Para dividir, retire el medio y enjuague con PBS. Retire el PBS y reemplácelo con un volumen mínimo de tripsina fresca 1x (0,5 ml para T25 o 1,5 ml para T75). Revuelva suavemente para cubrir todas las superficies con tripsina. Incubar a 37 °C durante ~5 min. Controle el desprendimiento de las células de la placa utilizando un microscopio óptico de baja potencia.
2. Cuando la mayoría de las células parezcan redondeadas o desprendidas, añada 5 volúmenes (es decir, en comparación con el volumen de tripsina añadido) de medio EGM-2 completo precalentado y pipetee suavemente sobre la superficie del matraz para separar todas las células.
3. Cuente las células endoteliales con un hemocitómetro como se describe en 1.6-1.7. Granular las células por centrifugación (5 min, 1.200 x g). Retire el sobrenadante. Ajuste la concentración a 0,5 millones de células por ml mediante la adición de medios EGM-2 MV completos precalentados.
4. Transfiera las alícuotas de las celdas a las placas o matraces recubiertos de FN apropiados para su mantenimiento. Agite suavemente y colóquelo en la incubadora. Cambie el medio dentro de las 6-12 horas posteriores al enchapado. A partir de entonces, los medios deben cambiarse aproximadamente cada 48 horas.

>4. Transfección de células endoteliales

NOTA: Las células endoteliales primarias son refractarias a la transfección por los métodos químicos y de electroporación más comunes. El método basado en la transfección nuclear que se describe a continuación permite una eficiencia de transfección relativamente alta (~50-70%). Un método alternativo eficaz es el uso de la infección por vectores virales apropiados (véanse los comentarios en la Tabla de Materiales).

1. Prepare matraces T25 o T75 (según sea necesario) de HLMVEC o HDMVEC hasta una densidad final de confluencia del 90-95%. Cubrir con fibronectina (FN) 20ug/ml en PBS en condiciones estériles, ya sea placas de cultivo de microscopio como placas Delta-T (para el paso 5) o cubreobjetos de vidrio circulares de 12 mm colocados dentro de un pocillo de una placa de cultivo celular de 24 pocillos (para el paso 6) con como se describe anteriormente (2.1).
2. Añada 1 ml de medio de cultivo EGM-2 completo a las placas de cultivo del microscopio o 0,5 ml a cada 24 pocillos y equilibre las placas en una incubadora humidificada a 37 °C/5% de CO₂.
3. Recoja y cuente las células endoteliales como en los pasos 3.1-3.3. Centrifugar el volumen requerido de células (0,5 millones de células por muestra) a 1.200 x g durante 5 min en RT. Vuelva a suspender la pastilla de células con cuidado en 100 μl de solución de transfección nuclear RT por muestra.
4. Combine 100 μl de suspensión celular con 1-5 μg de ADN. Transfiera la célula/suspensión de ADN a una cubeta certificada; La muestra debe cubrir el fondo de la cubeta sin burbujas de aire.
   NOTA: Las construcciones dirigidas a YFP o DsRed a la membrana celular (a través de los 20 aminoácidos N-terminales de la neuromodulina que contiene una señal para la palmitoilación postraduccional) se utilizaron solas (membrana-YFP solo o membrana-DsRed sola) o co-transfectadas con un marcador volumétrico citoplasmático (p. ej., membrana-YFP y DsRed soluble). Se pueden utilizar muchas permutaciones de marcadores de proteínas fluorescentes.
5. Cierre la cubeta con la tapa. Inserte la cubeta con suspensión de célula/ADN en el soporte de cubeta del electroporador y aplique el programa de electroporación S-005. Saque la cubeta del soporte una vez finalizado el programa.
6. Añada ~500 μl de los medios de cultivo preequilibrados a la cubeta y retire suavemente la suspensión celular de la cubeta utilizando las pipetas de transferencia de plástico proporcionadas en el kit de transfección nuclear.
7. Para los experimentos en los que se utiliza un microscopio, las placas de cultivo dividen la suspensión celular de una reacción en partes iguales entre dos placas que contienen medios precalentados (Pasos 4.2-4.3). Para experimentos con 24 pocillos/placas, divida una reacción en partes iguales entre 3 pocillos.
8. Incubar las células en una incubadora humidificada a 37 °C/5% de CO₂ y cambiar de medio durante 4-6 horas, y de nuevo a las 12-16 horas después de la transfección.

>5. Imágenes y análisis de células vivas

1. Preparación del endotelio
   1. Día 0: Co-transfectar HLMVECs primarios con YFP de membrana y DsRed soluble a través de una tecnología de nucleofección como se describe en el paso 4 y placa en placas de cultivo de imágenes de células vivas.
   2. Día 1: Reemplace el medio con medio fresco que contenga IFN-γ (100 ng/ml) para inducir la expresión de MHC-II. El día 2. Estimular las células transfectadas mediante la adición de 20 ng/ml de TNF-α a los medios existentes.
   3. El día 3, incubar el endotelio con 1 μg/ml de superantígenos bacterianos enterotoxina estafilocócica B (SEB) y toxina 1 del síndrome de shock tóxico (TSST) a 37 °C durante 30-60 minutos inmediatamente antes de los experimentos. Omita este paso para las condiciones de control '-Ag'.
2. Preparación de linfocitos
   1. Paralelamente con el paso 5.1.3, prepare el tampón A (HBSS sin rojo de fenol) suplementado con 20 mM de HEPES, pH 7,4 y albúmina sérica humana al 0,5% v/v precalentada a 37 °C. Tomar una muestra de linfocitos cultivados y determinar la densidad contando con un hemocitómetro (Paso 1.12-1.17).
   2. Centrifugar 2 millones de células por muestra a 1.200 x g durante 5 min a RT en un tubo cónico de 15 ml. Aspire el medio y vuelva a suspender suavemente el pellet de células en 2 ml de tampón A de modo que no queden grupos de células.
   3. Retire una alícuota fresca de colorante de calcio Fura-2 y vuelva a suspender en DMSO para obtener una concentración de caldo de 1 mM.
   4. Agregue 2 μl de solución madre de Fura-2 a la suspensión de células T (concentración final de 2 μM), tape el tubo y mezcle inmediatamente invirtiendo el tubo para asegurar una dispersión uniforme del colorante. Incubar a 37 °C durante 30 min.
   5. Centrífuga como en el paso 5.2.2. Aspire Buffer-A y resuspenda los linfocitos de forma suave pero completa en 20-40 μl de Buffer-A fresco.
3. Configuración y adquisición de imágenes de células vivas
   NOTA: Se puede emplear una amplia variedad de sistemas para la obtención de imágenes de fluorescencia de células vivas en microscopios de luz vertical e invertida. Los requisitos básicos incluyen una fuente de luz de fluorescencia y filtros, una cámara CCD, conmutación de filtros motorizada y obturadores, una etapa calefactada (o una cámara calefactorizada montable en un microscopio) y software para la adquisición automatizada de imágenes. Para este protocolo, se requieren lentes de inmersión en aceite de alta apertura numérica y alto aumento (es decir, 40X, 63X) para lograr la resolución espacial necesaria. Se debe tener especial cuidado al elegir la fuente de fluorescencia y las lentes adecuadas para la obtención de imágenes de calcio basadas en Fura-2, ya que no todas son compatibles con las longitudes de onda de excitación de 340/380 nm requeridas. Se puede utilizar un enfoque alternativo (compatible con los conjuntos de filtros de fluorescencia verde y roja estándar) con tintes sensibles al calcio no radiométricos (por ejemplo, Fluo-4, Rhod-3), aunque estos no pueden cuantificar con precisión el flujo de calcio y solo proporcionan una lectura relativa/cuantitativa.
   1. Encienda el sistema de microscopio (PC para su funcionamiento, microscopio, cámara CCD, rueda de filtros y lámpara de xenón).
   2. Abra el software designado.
   3. Configure el microscopio/software para la obtención automatizada de imágenes de lapso de tiempo multicanal. Incluye la adquisición secuencial de un contraste de interferencia diferencial (DIC), fluorescencia verde estándar, fluorescencia roja estándar e imágenes Fura-2 de excitación estándar de 340 y 380 nm. Establezca el intervalo de adquisición para 10-30 segundos y una duración total de ~20-60 minutos.
      1. Ajuste los tiempos de exposición para las imágenes de Fura-2.
         1. Agregue aceite de objetivo nuevo y monte una placa de microscopio que contenga solo 0,5 ml de Buffer-A en el adaptador de la etapa de calentamiento y enciéndala inmediatamente para equilibrar a 37 °C (tomará ~ 2-3 min).
         2. Añada linfocitos cargados de Fura2 en reposo a la cámara de la placa del microscopio montada con una pipeta de 20 μl.
         3. Activa las imágenes de campo claro. Seleccione la trayectoria de la luz hacia los oculares. Utilice la perilla de enfoque grueso para poner el objetivo en contacto con la parte inferior de la antena del microscopio. Utilice el ocular y la perilla de enfoque fino para enfocar las células T ubicadas en el fondo del plato.
         4. Utilice los controles de etapa x-y para seleccionar un campo que contenga al menos 10 celdas. Evite los campos superpoblados y los grupos de células, ya que crearán artefactos de imagen.
         5. Cambie de una fuente de luz de campo brillante a una fuente de luz fluorescente. Cambie de la imagen del ocular a la cámara CCD. Establezca los parámetros de adquisición (por ejemplo, tiempo de exposición, ganancia del detector y agrupación). Con el software, adquiera imágenes Fura2-340 y Fura2-380 en reposo (comenzando con un tiempo de exposición idéntico para cada una, generalmente en el rango de ~ 200-1,000 mseg).
         6. Utilice los métodos descritos en el paso 5.4.1 para calcular el Fura2-340/Fura2-380 para cada linfocito. Realice iteraciones repetidas de ajuste de los tiempos de exposición de Fura2-340 y Fura2-380, adquiriendo imágenes y calculando proporciones hasta que los valores promedio estén cerca de 1.
      2. Establezca los tiempos de exposición para mem-YFP y DsRed.
         1. Sustituya la antena de microscopio utilizada en el paso 5.3.3.1 por una antena de microscopio que contenga HLMVEC o HDMVEC transfectados, activados y tratados con SAg (o sin tratar; control) de la incubadora de cultivos celulares (pasos 4.5.1). Utilice una pipeta de transferencia desechable para eliminar rápidamente los medios, enjuague una vez la adición de ~ 1 ml de tampón A precalentado. Aspire y luego agregue 0,5 ml de Tampón-A.
         2. Identificar los campos en los que las células endoteliales transfectantes positivas brillantemente fluorescentes están presentes y parecen sanas con uniones intercelulares bien formadas.
         3. Ajuste los parámetros de adquisición (por ejemplo, tiempo de exposición, ganancia del detector y agrupamiento) para mem-YFP y DsRed. Asegúrese de que la intensidad media de la señal de fluorescencia en cada canal se encuentre entre el 25% y el 75% del rango dinámico del detector.
4. Realizar experimentos de imágenes con células vivas.
   1. Utilice software automatizado para comenzar la adquisición de imágenes y capture varios intervalos de imágenes para establecer una línea de base.
   2. Durante la adquisición, aplique ~5 μl de linfocitos concentrados cargados de Fura-2 (del paso 5.2) al centro del campo de imágenes de la placa del microscopio insertando la punta de una pipeta de pequeño volumen (P-5 o P-20) en el medio cerca del centro del objetivo y expulsándola lentamente.
   3. A medida que los linfocitos se asientan en el campo de imágenes, realice ajustes finos en el enfoque para asegurarse de que la interfaz entre las células T y las células endoteliales (sinapsis inmunológicas) se mantenga en el plano focal. Con objetivos de 40 y 63X, ~10-20 celdas por campo son óptimas. Si se observan menos células en el campo de imagen, repita el paso 5.3.4.2.
   4. Una vez completado el intervalo de observación deseado del experimento, continúe con la obtención de imágenes e inyecte inmediatamente ionomicina directamente en la placa del microscopio (utilizando la técnica indicada en 5.3.4.2) hasta una concentración final de 2 μM para inducir el flujo máximo de calcio/señal de señalización de Fura-2 (es decir, un medio de calibración, véase el análisis 5.4.).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Torniquete sin látex elástico BD Vacutainer	BD Biociencias	367203
Hisopos con alcohol BD	BD Biociencias	326895
BD Vacutainer Safety-Lok	BD Biociencias	367861	K2 EDTA
BD Vacutainer Juego de Extracción de Sangre con Botón Pulsador	BD Biociencias	367335
RPMI-1640	Sigma-Aldrich	R8758-1L
Ficoll-Paque	Sigma-Aldrich	GE17-1440-02	Llevar a RT antes de usar
FCS-Optima	Productos biológicos de Atlanta	S12450	Calor inactivado
Penicilina-Estreptomicina	Sigma-Aldrich	P4458-100ML
Azul de tripano	Sigma-Aldrich	T8154-20ML
Enterotoxina estafilocócica B	Tecnología de toxinas	BT202RED	Solución madre 1mg/ml en PBS
Síndrome de shock tóxico toxina 1	Tecnología de toxinas	TT606RED	Solución madre 1mg/ml en PBS
IL-15 humana	Sistemas de investigación y desarrollo	247-IL-025	Solución madre 50ug/ml en PBS
Pbs	Tecnologías de la Vida	10010-049
Fibronectina	Tecnologías de la Vida	33016-015	Solución madre 1mg/ml en H20
HMVEC-d Ad-Dermal MV Endo Células	Lonza	CC-2543	pueden utilizar otras CE microvasculares humanas, es decir, HLMVEC
Kit de balas EGM-2 MV	Lonza	CC-3202
Tripsina-EDTA	Sigma-Aldrich	T-4174	Solución madre 10x, diluida en PBS
Kit de nucleofactor Amaxa-HMVEC-L	Lonza	VPB1003	Kit necesario para el paso 4
IFN-g	Sigma-Aldrich	I3265	Solución madre 1mg/ml en H20
TNF-alfa 10ug, humano	Tecnologías de la Vida	PHC3015	Solución madre 1mg/ml en H20
Fenol Rojo sin HBSS	Tecnologías de la Vida	14175-103
Hepes	Fisher Científico	BP299-100
Cloruro de calcio	Sigma-Aldrich	C1016-100G	Solución madre 1M en H20
Cloruro de magnesio	Sigma-Aldrich	208337	Solución madre 1M en H20
Albúmina sérica humana	Sigma-Aldrich	A6909-10ml
Immersol 518 F Aceite de inmersión sin fluorescencia	Fisher Científico	12-624-66A
Fura-2 AM 20x50ug	Tecnologías de la Vida	F1221	Solución madre 1mM en DMSO
pEYFP-Mem (Mem-YFP)	Clontech	6917-1
Monómero pDsRed (DsRed citoplasmático soluble)	Clontech	632466
Membrana de monómero pDsRed (Mem-DsRed)	Clontech	632512
pEGFP-actina	Clontech	6116-1
Alexa Fluor 488 Faloidina	Tecnologías de la Vida	A12379
Tubos de centrífuga cónicos Falcon 15mL	Fisher Científico	14-959-70C
Tubos de centrífuga cónicos Falcon 50mL	Fisher Científico	14-959-49A
Matraces tratados para cultivo de tejidos Falcon T25	Fisher Científico	10-126-9
Matraces tratados para cultivo de tejidos Falcon T75	Fisher Científico	13-680-65
Cultivo celular de Corning T175 tratado	Fisher Científico	10-126-61
Cubreobjetos de vidrio	Fisher Científico	12-545-85	12 mm de diámetro
Placas de cultivo de tejidos Falcon de 24 pocillos	Fisher Científico	08-772-1
Placas Delta-T	Bioptechs	04200415B
Pipetas desechables Pasteur Wheaton	Fisher Científico	13-678-8D
Tubo Eppendorf de 1,5 ml	Fisher Científico	05-402-25
ICAM1 ratón anti-humano	BD Biociencias	555509
Ratón HS1 anti-humano	BD Biociencias	610541
Anti-humano CD11a (LFA-1alpha) Purificado	ebiociencia	BMS102
Anti-humano CD3 Alexa Fluor® 488	ebiociencia	53-0037-41
Anticuerpo anti-MHC de clase II	Abcam	AB55152
Anticuerpo anti-Talin 1	Abcam	AB71333
Anticuerpo anti-PKC theta	Abcam	AB109481
Fosfotirosina (4G10 Platino)	Millipore	50-171-463
Nucleofector II	Amaxa Biosystems		Electroporador requerido para el paso 4
Zeiss Axiovert	Carl Zeiss MicroImaging
Zeiss LSM510	Carl Zeiss MicroImaging
Software Zeiss Axiovison	Carl Zeiss MicroImaging
NU-425 (Serie 60) Cabina de Seguridad Biológica	NuAIRE	Nu-425-600
Forma STRCYCLE 37 °C, 5% CO2 Incubadora de cultivo celular	Fisher Científico	202370
centrífuga 5810	Eppendorf	EW-02570-02
Hemotómetro	Sigma-Aldrich	Z359629	Hemocitómetro Bright-Line
Baño de agua Isotemp modelo 202	Fisher Científico	15-462-2