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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Modelo de ratón transgénico para el desarrollo del cáncer de mama
- Observe los ratones del modelo de cáncer deseado para el crecimiento tumoral adecuado a través de la palpación o la medición del calibre antes de continuar.
nota: En este caso, se utilizó el modelo murino transgénico de desarrollo de cáncer de mama (FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J) (MMTV-PyMT). Estos animales desarrollan espontáneamente carcinomas de mama invasivos entre las 6 y las 12 semanas de edad en cada glándula mamaria. Se utilizaron glándulas mamarias normales como controles de los compañeros de camada transgénicos negativos y de la misma edad.
>2. Inyección intravenosa de agentes de anticuerpos específicos e inespecíficos
- Purifique los anticuerpos de control del isotipo B7-H3 y de inmunoglobulina G (IgG) de conejo en una columna de desalinización (por ejemplo, PD-10) para eliminar los conservantes y los tampones de almacenamiento siguiendo las instrucciones del fabricante
nota: Algunos anticuerpos pueden necesitar una mayor purificación con el protocolo basado en perlas de agarosa de proteína A.
- Dosis alícuotas de 33 μg de cada conjugado de anticuerpo en tubos de microcentrífuga individuales.
nota: La dosis del agente administrado puede variar en función de la aplicación y coincide con las dosis a las que se utiliza habitualmente el conjugado de anticuerpos. La concentración de las soluciones de anticuerpos es necesaria si el volumen es superior a 100 μL para la seguridad de los animales.
- En el momento deseado antes de la recolección de tejido, aquí 96 h, anestesiar al animal portador de tumores con isoflurano al 2% que fluye en oxígeno a 2 L/min, y colocar en una etapa calentada a 37 °C. Pellizque un dedo del pie para asegurarse de que se alcanzó el nivel adecuado de anestesia antes del procedimiento.
- Para prepararse para la inoculación de las soluciones de anticuerpos en las venas de la cola, desinfecte la cola del animal limpiándola tres veces con una toallita con alcohol. Dilate las venas de la cola calentándolas con una almohadilla térmica durante aproximadamente 30 segundos. Evite calentar todo el animal. Limpie la cola una vez más con una toallita con alcohol después de quitar la almohadilla térmica.
- Con un catéter de vena de cola 27G, inserte la aguja de mariposa en una de las dos venas laterales de la cola y fije cuidadosamente la cola con la aguja insertada a la etapa con un trozo de cinta quirúrgica><.
nota: El reflujo sanguíneo visible en el catéter indica la ubicación correcta de la aguja dentro de la vena de la cola.
- Enjuague el catéter con 25 μL de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) y luego inyecte la solución de anticuerpos en el catéter con jeringas de insulina. Enjuague el catéter una vez más con 25 μL de PBS estéril.
- Retire la aguja de la cola y aplique presión para detener el sangrado.
- Apague la anestesia y observe al animal hasta que esté completamente despierto para detectar cualquier signo de angustia.
>3. Recolección y preparación de tejidos tumorales diana
- En el momento deseado, eutanasiar humanamente al animal de acuerdo con el procedimiento institucional aceptable, en este caso, mediante la inhalación gradual de 100% deCO2 de un tanque de gas comprimido con un caudal de desplazamiento de la cámara de 10-30% vol./min.
nota: Algunas aplicaciones de la técnica IVIL requieren eutanasia por perfusión cardíaca con PBS para eliminar los anticuerpos que circulan libremente.
- Después de la confirmación de la eutanasia humanitaria mediante el cese del movimiento respiratorio y cardíaco, la falta de respuesta al pellizco de los dedos de los pies y el encanecimiento de las membranas mucosas, extirpar los tejidos tumorales con tijeras quirúrgicas y fórceps de la siguiente manera:
- Coloque el ratón en posición supina y agarrando solo la capa externa de piel entre el conjunto de glándulas mamarias más cercanas a la cola (5ª) con pinzas, haga una pequeña incisión con unas tijeras quirúrgicas.
- Introduce las tijeras cerradas en el corte y abre lentamente la punta para separar cuidadosamente la piel de la membrana de la pared abdominal subyacente, manteniéndola intacta.
- Haga una incisión vertical en el abdomen, continuando separando la piel de la membrana interna. Entre la 3ª y 4ª glándulas mamarias, hacer un corte horizontal a través del abdomen para permitir la retracción de la piel y la visualización de las glándulas mamarias.
nota: Los tumores y las glándulas mamarias se localizan superficialmente debajo de la piel.
- Agarrando cada tumor o glándula normal con fórceps, corte cuidadosamente la piel adherida con unas tijeras quirúrgicas.
- Coloque los pañuelos extirpados en moldes de base desechables de pañuelos, preetiquetados y llenos con medio de inclusión de temperatura de corte óptima (OCT), y congele los moldes rápidamente colocándolos sobre hielo seco. Con el fin de estudiar la administración fuera del objetivo, extirpe otros tejidos u órganos de interés (por ejemplo, el hígado o los pulmones).
nota: Para pausar el protocolo en este punto, almacene los bloques de papel congelado a -80 °C hasta que esté listo para continuar.
- Con un criostato, corte los bloques de tejido congelado de 10 μm de espesor y coloque las secciones adyacentes en portaobjetos de vidrio de adhesión preetiquetados.
nota: Para pausar el protocolo en este punto, guarde las diapositivas a -80 °C hasta que estén listas para continuar.
>4. Protocolo de tinción ex vivo
NOTA: Para la comparación cuantitativa entre imágenes de microscopía de fluorescencia, todos los portaobjetos se tiñen al mismo tiempo con las mismas soluciones preparadas.
- Enjuague los portaobjetos de papel congelados con PBS a temperatura ambiente durante 5 minutos para eliminar la OCT.
- Demarque las secciones de tejido con un bolígrafo de barrera hidrofóbica para reducir el volumen de soluciones necesarias durante la tinción.
nota: Tenga cuidado de no permitir que la pluma pase por encima de las muestras de tejido, ya que puede eliminar el tejido del portaobjetos o impedir la tinción adecuada en la parte de tejido afectada. No permita que las secciones de tejido se deshidraten en ningún momento.
- Fije las secciones de tejido con una solución de paraformaldehído al 4% durante 5 min.
- Enjuague los portaobjetos en PBS durante 5 min.
- Permeabilizar secciones de tejido con Triton-X 100 al 0,5% en PBS durante 15 min.
- Enjuague los portaobjetos en PBS durante 5 min.
- Bloquear los tejidos con 3% p/v de suero bovino (BSA) y 5% v/v de suero de cabra, ambos en PBS (solución bloqueante) durante 1 h a temperatura ambiente.
nota: Haga coincidir el suero de la solución bloqueante con el animal huésped del anticuerpo secundario.
- Enjuague los portaobjetos en PBS durante 5 min.
- Incubar secciones con anticuerpos primarios que lleven un registro, según se desee, posiblemente un marcador nuclear común (por ejemplo, DAPI), vascular (por ejemplo, CD31) o citoplasmático (por ejemplo, actina). En este caso, se utilizó CD31 (marcador vascular) anti-ratón en ratas en una dilución de 1:100 de acuerdo con las instrucciones del fabricante en la solución de bloqueo durante la noche a 4 °C protegida de la deshidratación en una bandeja de portaobjetos.
nota: No agregue anticuerpo primario o conjugado de anticuerpo adicional. El conjugado que se inyectó y se permitió que se acumulara en los tejidos in vivo actúa como anticuerpo primario.
- Enjuague los portaobjetos en PBS durante 5 minutos tres veces, cambiando el PBS cada vez.
- Incubar portaobjetos con anticuerpos secundarios para marcar los anticuerpos primarios. Para esta aplicación, visualice el anticuerpo anti-B7-H3 utilizando el anticuerpo anti-conejo conjugado de cabra AlexaFluor-546 (dilución 1:200, optimizado según las instrucciones del fabricante) y CD31 con el anticuerpo secundario anti-rata de cabra AlexaFluor-488 (dilución 1:200, optimizado según las instrucciones del fabricante) en solución de bloqueo, protegida de la luz y la deshidratación en una bandeja de portaobjetos, durante 1 h a temperatura ambiente.
nota: Los anticuerpos secundarios proceden del mismo animal huésped, pero coinciden con la afinidad de los anticuerpos secundarios con la especie huésped del anticuerpo primario respectivo. A partir de este punto, los toboganes están protegidos de la luz.
- Enjuague los portaobjetos en PBS durante 5 minutos tres veces, cambiando el PBS cada vez.
- Aplique una gota del medio de montaje en el centro de la rebanada de pañuelo y coloque con cuidado un cubreobjetos evitando que queden atrapadas las burbujas de aire.
- Selle los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas transparente y déjelo secar.
nota: Para pausar el protocolo hasta una semana en este punto, guarde las diapositivas a -20 °C hasta que esté listo para continuar.
5. Imágenes de microscopía confocal y análisis cuantitativo de imágenes
NOTA: La preparación del microscopio confocal y los parámetros de imagen dependerán del sistema confocal utilizado. El microscopio utilizado aquí se compró comercialmente (por ejemplo, el sistema Zeiss LSM 510 Meta) y se utilizó el software de adquisición asociado (por ejemplo, Zen 2009). Sin embargo, muchos de estos pasos se aplicarán a cualquier microscopio confocal y supondrán conocimientos básicos de microscopía confocal.
- Después de que el sistema se haya encendido y calentado, seleccione el objetivo deseado; aquí se utilizó un objetivo de 20x (apertura numérica = 0.8).
- Cargue una corredera de control positivo, con la cubierta hacia abajo, para permitir la configuración de la optimización de la señal más brillante. Imágenes en el canal rojo, enfoque el sistema en la muestra en el modo de imágenes en vivo.
- Para cada canal láser utilizado, optimice la intensidad del láser, la ganancia maestra y el tamaño del agujero de alfiler de la siguiente manera:
- Cambie al modo continuo para la obtención de imágenes.
- Optimice las barras deslizantes Intensidad del láser (que controla la potencia del láser) y Ganancia (Maestro) (que controla el voltaje del tubo fotomultiplicador) mientras monitorea el histograma de la tabla de búsqueda (LUT). Ajuste estas dos configuraciones hasta que el rango dinámico del histograma se llene sin saturar píxeles.
nota: Si la intensidad del láser es demasiado alta, se producirá un fotoblanqueo. Si la ganancia (maestra) es demasiado alta, la imagen se volverá ruidosa. Idealmente, la Ganancia (Maestro) estará en el medio de su rango.
- Ajuste el orificio a 1 unidad aireada (AU), lo que proporciona la resolución más alta y el corte en Z más delgado.
- Deslice la barra de compensación digital para minimizar el ruido de fondo en el histograma de LUT para obtener un fondo negro verdadero.
nota: Una vez que los ajustes de microscopía estén optimizados para cada canal láser y objetivo, manténgalos constantes durante toda la sesión de imágenes y para la obtención de imágenes de todos los portaobjetos, para permitir la comparación cuantitativa entre portaobjetos.
- En la pestaña Modo de adquisición, en Promedio, seleccione el número y la profundidad de bits deseados. Haga clic en el botón Óptimo para establecer el tamaño de píxel óptimo.
- Utilice el botón Adquisición de snap para capturar una imagen de alta calidad. En este caso, se seleccionaron campos de visión aleatorios desde el interior del tumor, pero otras áreas de interés pueden aplicarse a diferentes aplicaciones (vasos, márgenes tumorales, profundidad de penetración, etc.)
- Guarde los archivos de imagen en el formato utilizado por el software confocal (en este caso, ".lsm") para el procesamiento y la cuantificación fuera de línea.
nota: Si no se muestran todas las diapositivas durante la misma sesión, guarde la configuración y vuelva a cargarla en las visitas posteriores, aunque no se recomienda volver a tomar imágenes de la misma diapositiva debido al fotoblanqueo.
- Realizar las mediciones cuantitativas de intensidad de fluorescencia. Abra Fiji (software Fiji Is Just ImageJ) y cargue un archivo de imagen .lsm arrastrándolo a la barra de estado.
- Divida los datos del canal de color. Ve a Imagen > Apilas > Canales divididos.
- Preprocese las imágenes de fluorescencia según sea necesario, es decir, reste la señal de fondo (Procesar > restar fondo) o reduzca el ruido mediante un método de filtrado.
- Segmente el canal de color correspondiente a la proteína de referencia (tinción vascular, nuclear, celular) estableciendo un umbral en la intensidad de la señal (Imagen > Ajustar > Umbral).
nota: El umbralización manual introduce subjetividad en el análisis de imágenes, por lo tanto, el uso de un algoritmo de umbrales automatizado o la referencia a histogramas de imágenes hace que los resultados del análisis de imágenes sean menos sesgados.
- Utilice este umbral para crear una máscara binaria (Procesar > binario > convertir en máscara).
- Mida y etiquete el ROI dentro de la máscara (Analizar > Analizar partículas > Marque Agregar al administrador > Aceptar).
- Aplique ROI al canal de color correspondiente al anticuerpo de interés (Haga clic en la imagen del canal, Analizar > Herramientas > Administrador de ROI > Medir). Esto aplicará los ROI de la mascarilla a la imagen de anticuerpos y proporcionará mediciones de imagen para las secciones de la etiqueta en la ventana Resultados. Ventana Guardar resultados (Archivo > Guardar).
- Calcule la estadística de interés deseada, como la intensidad de fluorescencia media como se describe aquí.
- Realice todos los pasos de procesamiento de forma idéntica a cada imagen dentro de un conjunto de diapositivas. Cree una macro para hacer esto automáticamente para grandes lotes de imágenes.
- Para la visualización de imágenes solo después de mediciones cuantitativas, aplique ajustes cualitativos de imagen para optimizar la visualización de los patrones de biodistribución ajustando el mínimo, el máximo, el brillo y el contraste a los mismos niveles en todas las diapositivas (Ajuste de > de imagen > Brillo/Contraste).
- Convierta el tipo de imagen (Tipo de imagen > > Color RGB) y guarde los archivos en un tipo de imagen sin pérdidas, como .tiff (Archivo > Guardar como > Tiff...) para su uso en presentaciones y publicaciones.