Un inmunoensayo multiplex basado en perlas para identificar anticuerpos específicos de patógenos en la saliva

Abstract

Fuente: Augustine, S. A. J., et al. Desarrollo de un inmunoensayo múltiple de anticuerpos salivales para medir la exposición humana a patógenos ambientales. J. Vis. Exp. (2016).

Este video muestra una técnica de inmunoensayo multiplex basada en perlas para detectar simultáneamente anticuerpos contra múltiples patógenos ambientales en la saliva humana. Las perlas fluorescentes se acoplaron a antígenos de diferentes patógenos, que se capturaron utilizando anticuerpos en la muestra de saliva humana. Al marcar los anticuerpos con un indicador fluorescente, las perlas se analizaron mediante citometría de flujo para evaluar la presencia de diferentes anticuerpos específicos del patógeno en la saliva.

Protocol

1. Acoplamiento de cuentas

1. Acople los antígenos a los conjuntos de cuentas utilizando las concentraciones que se muestran en la Tabla 1.
2. Agregue cada antígeno a las perlas activadas y lleve el volumen total a 500 μl en 50 mM MES, pH 5.0. Mezclar los antígenos y las perlas por vórtice.
3. Incubar los antígenos y las perlas durante 2 horas con mezcla por rotación (~15 rpm) a temperatura ambiente en la oscuridad. Granular las perlas acopladas por microcentrifugación a 10.000 x g durante 2 min.
4. Retirar el sobrenadante y volver a suspender las perlas en 500 μl de solución salina tamponada con fosfato (PBS)-albúmina sérica bovina (BSA)-monolaurato de polioxietileno sorbitán (Tween-20)-azida sódica (PBS-TBN) pH 7,4 mediante vórtice y sonicación. Granular las perlas por microcentrifugación a 10.000 x g durante 2 min y eliminar el sobrenadante.
   cautela: La azida de sodio es una sustancia química extremadamente tóxica. Es mortal si se ingiere o entra en contacto con la piel. No respire polvo/humos/gases/neblina/vapores ni aerosoles. Use el equipo de protección personal (EPP) adecuado cuando lo manipule y deseche de acuerdo con las leyes pertinentes.
5. Vuelva a suspender las perlas en 1 ml de PBS-TBN por vórtice y sonicación durante 20 segundos.
6. Granular las perlas por microcentrifugación a 10.000 x g durante 2 min.
7. Repita los pasos 1.5 y 1.6.
   nota: Esto proporciona un total de dos lavados con PBS-TBN.
8. Vuelva a suspender las perlas acopladas y lavadas en 1 ml de PBS, 1% BSA, 0,05% Azida, pH 7,4. Guarde las cuentas acopladas en un refrigerador de 2-8 °C en la oscuridad.

>2. Inmunoensayo Multiplex Salival

1. Retire la saliva del congelador a -80 °C y deje que se descongele a temperatura ambiente.
2. Vuelva a suspender las existencias de perlas acopladas a antígeno por vórtice y sonicación durante 20 segundos.
3. Prepare una mezcla de perlas de trabajo diluyendo las existencias de perlas acopladas hasta una concentración final de 100 perlas/μl de cada conjunto de perlas único en tampón PBS-1% BSA.
4. Prepare una dilución 1:4 de saliva con tampón PBS-1% BSA en una placa de pocillos profundos de 96 pocillos.
5. Humedecer previamente la placa filtrante con 100 μl de tampón de lavado y eliminar el sobrenadante al vacío.
6. Añada 50 μl de una mezcla de perlas de trabajo y un volumen igual de saliva diluida a 95 pocillos de las placas de filtro de 96 pocillos para una dilución final de 1:8. Reacciones de mezcla con una pipeta multicanal. Al pocillo de control, agregue 50 μl de perlas acopladas al antígeno más 50 μl de tampón PBS-1% BSA (como reemplazo de la saliva).
7. Cubra y deje incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 1 hora en un agitador de microplacas a 500 rpm. Eliminar el sobrenadante al vacío. Lave los pocillos con 100 μl de tampón de lavado y elimine el sobrenadante al vacío. Repita el lavado 1 vez.
8. Vuelva a suspender las perlas en 50 μl de PBS-1% BSA con una pipeta multicanal.
9. Anticuerpo de detección secundaria anti-IgG humano de cabra biotinilado diluido a 16 μg/ml en PBS-1% BSA.
10. Añadir 50 μl de anticuerpo secundario diluido a cada pocillo y mezclar el contenido con una pipeta multicanal.
11. Cubra la placa del filtro y déjela incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos en un agitador de placas. Eliminar el sobrenadante al vacío. Lave los pocillos con 100 μl de tampón de lavado y elimine el sobrenadante al vacío. Repita el lavado 1 vez.
12. Vuelva a suspender las perlas en 50 μl de PBS-1% BSA con una pipeta multicanal.
13. Diluir el reportero de estreptavidina-R-ficoeritrina (SAPE) a 24 μg/ml en PBS-1% BSA.
14. Añada 50 μl de reportero a cada pocillo y mezcle con una pipeta multicanal.
15. Cubra la placa del filtro y déjela incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos en un agitador de placas. Eliminar el sobrenadante al vacío. Lave los pocillos con 100 μl de tampón de lavado y elimine el sobrenadante al vacío. Repita el lavado 1 vez.
16. Vuelva a suspender las perlas en 100 μl de PBS-1% BSA y analice 50 μl con el analizador.
    nota: Los resultados del inmunoensayo multiplex se miden en unidades de intensidad de fluorescencia media (MFI). Consulte siempre la última versión del manual del software, si está disponible, para evitar errores.

Tabla 1: Mezcla de perlas de trabajo para el inmunoensayo multiplex.Una vez completado el acoplamiento y la confirmación, se preparó una mezcla maestra compuesta por cada juego de cuentas como se muestra. La mezcla maestra se distribuyó entre todos los pozos de la placa de 96 pocillos. Todos los pocillos se incubaron con saliva, con la excepción de un pozo de control de fondo que contenía solo perlas y tampón PBS-1% BSA.

antígeno	Juego de cuentas	Tampón de acoplamiento	Concentración de Ag (μg)	# de cuentas en 1 esquina	# de cuentas/μl	Vol. para 100 B/uL para 4 ml (μl)
C. jejuni	8	MES 5.0	50	64	6.400	94
H. pylori	33	MES 5.0	25	71	7.100	85
hepatitis A	42	MES 5.0	100	Artículo 91	9.100	66
T. gondii	30	MES 5.0	25	85	8.500	71
Norovirus GII.4	55	MES 5.0	5	72	7.200	83
Norovirus GI.1	Artículo 67	MES 5.0	5	63	6.300	95
Desacoplado	80	MES 5.0		60	6.000	100
		Volumen total de perlas (μl)				594
		Volumen total de tampón necesario (μl)				3.406

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipos y software
Microcentrífuga	Corporación Termo Electrón	75002446	Se utiliza para centrifugar muestras
Mezclador de vórtice	VWR	G560	Se utiliza para mezclar muestras
Sonicator (mini)	Fisher Científico	Teléfono 15-337-22	Se utiliza para separar cuentas
Pipettores P10, P20, P100, P1000, 8 ch.	Capp	varios
Colector de vacío multipantalla	Millipore	MSVMHTS00	Se utiliza en los pasos de lavado para eliminar el sobrenadante
MicroShaker	VWR	12620-926	Se utiliza para agitar las perlas durante las incubaciones
Gradilla de tubos (1,5 ml y 0,5 ml) (surtido)	VWR	30128-346
balanza	Mettler u otro		Se utiliza para medir reactivos de lavado para hacer tampones
Mezclador de muestras Dynabead	Invitrogen	947-01	Se utiliza durante la etapa de incubación del acoplamiento
MatLab (R2014b)	El proyecto MathWorks, Inc.		Se utiliza para analizar los datos de respuesta de anticuerpos
Microsoft Excel 2014	Corporación Microsoft		Se utiliza para analizar los datos de respuesta de anticuerpos
Analizador Luminex con software xPonent 3.1	Corporación Luminex	LX200-XPON3.1	Instrumento y software utilizados para ejecutar el ensayo
antígenos
GI.1 Virus de Norwalk: partícula p	Xi Jiang (CCHMC)*	Na	*Hospital Infantil de Cincinnati. Conc. final 5 μg.
GII.4 Norovirus VA387 : partícula p	Xi Jiang (CCHMC)*	Na	*Hospital Infantil de Cincinnati. Conc. final 5 μg.
Virus de la hepatitis A: concentrado de grado II procedente de cultivos celulares	Ciencias de la vida de Meridian	8505	Antígeno acoplado a 100 μg
Helicobacter pylori : lisado	Ciencias de la vida de Meridian	R14101	Antígeno acoplado a 25 μg
Toxoplasma gondii : p30 recombinante (SAG1)	Ciencias de la vida de Meridian	R18426	Antígeno acoplado a 25 μg
Campylobacter jejuni : células enteras muertas por el calor	KPL	50-92-93	Antígeno acoplado a 50 μg
Anticuerpos primarios
Conejillo de indias anti-norovirus	(CCHMC)*	Na	Se utiliza para la confirmación del acoplamiento
Ratón anti-Hepatitis A IgG	Ciencias de la vida de Meridian	C65885M	Se utiliza para la confirmación del acoplamiento
Ratón anti-Hepatitis A IgG	Ciencias de la vida de Meridian	C65885M	Se utiliza para la confirmación del acoplamiento
Anticuerpo purificado BacTraceAffinity contra Helicobacter pylori	KPL	01-93-94	Se utiliza para la confirmación del acoplamiento
PaAb de cabra a Toxoplasma gondii	Abcam	AB23507	Se utiliza para la confirmación del acoplamiento
BacTrace Especies de cabras anti-Campylobacter	KPL	01-92-93	Se utiliza para la confirmación del acoplamiento
Anticuerpos secundarios
Biotina-SP-Conjugada AffiniPure Donkey anti-Cabra IgG (H+L)	Jackson	705-065-149	Se utiliza para la confirmación del acoplamiento
Conejo biotinilado anti-Cabra IgG (H+L)	KPL	13-16-06	Se utiliza para la confirmación del acoplamiento
Cabra Biotinilada anti-Ratón IgG (H+L)	KPL	18-16-06	Se utiliza para la confirmación del acoplamiento
Anticuerpo purificado por afinidad Biotina marcado con cabra anti-conejo IgG (H + L)	KPL	176-1506	Se utiliza para la confirmación del acoplamiento
Anticuerpo purificado de afinidad Biotina marcada con cabra anti-IgG (γ)	KPL	16-10-02	Se utiliza para el inmunoensayo salival
Consumibles
Tubos de microcentrífuga de copolímero de 1,5 mL	Científico de EE. UU	1415-2500	Se utilizan como tubos de microcentrífuga de baja ligereza
Recargas de punta de pipeta de 10 μL	BioVentures	5030050C
Recargas de puntas de pipeta de 200 μl	BioVentures	5030080C
Recargas de punta de pipeta de 1000 μL	BioVentures	5130140C
papel de aluminio	Varios proveedores		Los perlas utilizados mantienen las perlas en la oscuridad durante las incubaciones
Placas de pozos profundos	VWR	40002-009	Se utiliza para diluir muestras de saliva
Placas de filtro multipantalla	Millipore	MABVN1250	Se utiliza para realizar ensayos
Sistema de recolección de saliva Oracol	Desarrollos Médicos de Malvern Limitada		Se utiliza para la recolección de saliva
Reactivos
Microesferas carboxiladas (perlas)	Corporación Luminex	Depende del juego de cuentas	Los antígenos se acoplan a las microesferas
EDC (clorhidrato de 1-etil-3-[3dimetilaminopropil] carbodiimida)	perforar	77149 o 22980	Se utiliza en la activación del cordón
Sulfo-NHS (N-hidroxisulfosuccinimida)	perforar	24510	Se utiliza en la activación del cordón
Steptavidin-R-ficoeritrina (1 mg/mL)	Sondas moleculares	S-866	Utilizado como reportero
MES (ácido 2-[N-morfolino]etanosulfónico)	sigma	M-2933	Se utiliza para el acoplamiento
Tween-20 (Polioxietilenosmonolaurato orbital)	sigma	P-9416	Se utiliza en el tampón de lavado para eliminar la unión no específica
Tampones proteicos
Búfer de bloqueo/almacenamiento PBS-TBN (PBS, 0,1 % BSA, 0,02 % Tween-20, 0,05 % azida, pH 7,4)**			Filtro Esterilizar y almacenar a 4°C
PBS, pH 7.4	sigma	P-3813	138 mM NaCl, 2,7 mM KCl
Bsa	sigma	A-7888	0.1% (p/v)
Preadolescente-20	sigma	P-9416	0.2% (v/v)
Azida de sodio (0,05% azida)**	sigma	S-8032	**Precaución: La azida de sodio es extremadamente tóxica. Evite el contacto con la piel y los ojos. Use EPP apropiados. Deséchelo de acuerdo con las leyes aplicables.
MES/ Tampón de acoplamiento (0,05 m MES, pH 5,0)
MES (ácido 2-[N-morfolino]etanosulfónico)	sigma	S-3139
5 N NaOH	pescador	SS256-500
Tampón de ensayo (PBS, 1% BSA, pH 7,4)			Filtro Esterilizar y almacenar a 4°C
PBS, 1% BSA, pH 7.4	sigma	P-3688	138 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 1% de BSA
Tampón de activación (0,1 M, NaH2, PO4, pH 6,2)			Filtro Esterilizar y almacenar a 4°C
NaH2PO4 (Fosfato de sodio, monobásico anhidro)	sigma	S-3139	0.1M NaH2PO4
5 N NaOH	pescador	SS256-500
Tampón de lavado (PBS, 0,05% Tween-20, pH 7,4)			Filtro Esterilizar y almacenar a 4°C
PBS, 0.05% Tween-20, pH 7.4	sigma	P-3563	138 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 0,05% TWEEN