Medición cuantitativa por citometría de flujo de la fagocitosis de esporas fúngicas por fagocitos humanos

Resumen

Fuente: Hartung, S., et al., Medición de la fagocitosis de los conidios de Aspergillus fumigatus por leucocitos humanos mediante citometría de flujo. J. Vis. Exp. (2019)

Este video muestra un método para cuantificar la fagocitosis de esporas de hongos patógenos marcados con FITC por leucocitos humanos. Las esporas fagocitadas se distinguen de las esporas adherentes a las células mediante la contratinción, seguida de un análisis de citometría de flujo.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.

1. Ensayo de fagocitosis

1. Incubar 2 x 10⁶ leucocitos y 4 x 10⁶ conidios marcados con FITC (multiplicidad de infección = 2) en 1,5 mL de RPMI + 10% FCS en una placa de cultivo celular de 12 pocillos. Como controles, incluya solo celdas (sin conidios) y celdas + conidios sin etiquetar.
2. Colocar en una incubadora de_CO2 humidificada a 37 °C e incubar durante el período de tiempo deseado (por ejemplo, 0,5 h, 2 h o 4 h).
3. Después de la incubación, recoja las células con un raspador de células y colóquelas en un tubo de 15 ml.
4. Girar durante 5 min a 300 x g a temperatura ambiente.
5. Recoja el sobrenadante para el análisis de citocinas o deséchelo si no lo desea. Vuelva a suspender cada muestra en 100 μL de PBS + 2 mM de EDTA.

>2. Tinción de anticuerpos

1. Para cada muestra, prepare 100 μL de mezcla de anticuerpos, incluido el anticuerpo anti-FITC APC, de acuerdo con la Tabla 1.
2. Coloque una muestra de 100 μL en un pocillo de una placa inferior en V de 96 pocillos. Añadir 150 μL de PBS + 2 mM de EDTA para el lavado.
3. Para la compensación de color, coloque 1 x 10⁶ celdas para cada color en los pocillos adicionales de la placa inferior en V de 96 pocillos. Incluya un pocillo de células que se deje sin teñir. Añadir 150 μL de PBS + 2 mM de EDTA para el lavado.
4. Cubra la placa con una lámina adhesiva.
5. Girar durante 5 min a 300 x g a temperatura ambiente. Retira el papel de aluminio.
6. Deseche el sobrenadante invirtiendo rápida y enérgicamente el plato solo una vez sobre el fregadero o con una toalla de papel desechable.
   NOTA: No repita ni golpee la placa sobre un papel hasta que se seque, ya que esto resultará en una pérdida masiva de células de la placa.
7. Vuelva a suspender las células en la mezcla de anticuerpos de 100 μL y mezcle bien mediante pipeteo.
8. Para la compensación de color, vuelva a suspender las células respectivas en 100 μL de PBS + 2 mM de EDTA y agregue un solo anticuerpo a cada pocillo en la misma cantidad utilizada en la mezcla de anticuerpos.
9. Cubrir con una lámina adhesiva e incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
10. Retira el papel de aluminio. Agregue 150 μL de PBS + 2 mM de EDTA a cada pocillo para lavar. Cubra con una lámina adhesiva.
11. Girar durante 5 min a 300 x g a temperatura ambiente. Retira el papel de aluminio. Deseche el sobrenadante invirtiendo rápida y enérgicamente el plato sobre el fregadero o una toalla de papel desechable.
12. Vuelva a suspender 200 μL de PBS + 2 mM de EDTA y transfiera las celdas de cada pocillo a un tubo de fondo redondo separado. Asegúrese de que no haya grupos de células en la suspensión. Elimine los clústeres de lo contrario.
    NOTA: Cada grupo que es lo suficientemente grande como para que el ojo lo vea es lo suficientemente grande como para obstruir potencialmente el citómetro.

>3. Citometría de flujo

1. Encienda el citómetro de flujo y deje que se caliente. Inicie el software de adquisición.
2. Cree un nuevo experimento y configure y etiquete las muestras.
3. Configure los parámetros (FSC 250, SSC 250) y los detectores para los fluoróforos FITC, APC, BUV395, V500 y PerCP-Cy5.5.
4. Configuración de la compensación
   1. Abra la configuración de compensación.
   2. Indique los colores individuales.
   3. Usando las celdas de control que no se han teñido o con tinciones individuales, configure los voltajes del detector PMT para incluir todos los eventos dentro de la escala.
   4. Registre al menos 10.000 eventos de cada control.
   5. Utilice la configuración de compensación para calcular el desbordamiento de los fluoróforos y aplicarlo a la configuración del citómetro del experimento.
5. Registro de datos de muestra
   1. Visualice FSC y SSC en el software de adquisición y establezca una puerta alrededor de los leucocitos.
   2. Con base en la puerta de leucocitos, muestre el diagrama de puntos SSC/CD45 y la puerta para que las células CD45⁺ se separen de los conidios.
   3. Muestre las células CD45⁺ en un diagrama de puntos CD14/CD66b y los monocitos de puerta (CD14⁺) y los neutrófilos (CD66b⁺) por separado.
   4. Visualización de neutrófilos en un diagrama de puntos anti-FITC/FITC.
   5. Usando la muestra con conidios no marcados, establezca cuadrantes para señales anti-FITC y FITC, permitiendo un máximo del 1% de las células en los cuadrantes respectivos.
   6. Repita los pasos 3.5.4 y 3.5.5 para la puerta de monocitos.
   7. Registre todas las muestras con al menos 20.000 eventos en la puerta de leucocitos.

Tabla 1: Mezcla de anticuerpos para citometría de flujo. Las cantidades de cada reactivo se dan en microlitros por muestra (1 x 10⁶ células) a analizar.

Reactivo	μl por muestra
CD45 BUV395	1
CD14 V500	0.5
CD66b PerCP-Cy5.5	1.5
anti-FITC APC	0.5
PBS + 2 mM EDTA	97
total	100

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Lámina adhesiva	marca	701367
Placa de cultivo celular, 12 pocillos	Greiner Bio-one	665180
citómetro	BD Biociencias		LSR Fortessa II, láseres: 488 nm (azul), 405 nm (violeta), 355 nm (UV) y 640 nm (rojo)
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)	Sigma Aldrich	ED3SS-500g	2 mM en PBS
Isotiocianato de fluoresceína (FITC)	Sigma Aldrich	F3651-100MG	0,1 mM en solución de Na2, CO,3 /PBS
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	ThermoFisher Scientific	189012-014	Sin Calcio, sin Magnesio
RPMI 1640	ThermoFisher Scientific	61870010	RPMI 1640 Medium, Suplemento GlutaMAX
Software para la adquisición y el análisis de datos	BD Biociencias
Placa inferior en V, 96 pocillos	marca	781601	Superficie sin tratar
Formaldehído	Carl Roth	PO87.3	Histofijo